余占娟 王月霞 呂豪 李向陽

325035 溫州醫(yī)科大學(余占娟、李向陽)；324000 衢州市中心血站(王月霞、呂豪)

有報道我國人群中HBsAg攜帶率為7.18%[1]，2005年報道顯示衢州市人群的HBsAg陽性率平均為3.21%，屬乙肝中流行[2]。如何降低輸血感染，確保輸血安全，一直是國內(nèi)外關注的熱點之一。由于條件限制，我國大多數(shù)血站一直采用兩種不同廠家的ELISA試劑檢測輸血傳染指標，雖然這個方法的檢測技術不斷在提高，但仍存在一定的局限性，窗口期、隱匿性乙肝、HBV基因突變等因素都可能造成HBV漏檢。

為進一步提高我國臨床用血安全水平、降低經(jīng)輸血傳播疾病風險，衛(wèi)生部在《全面推進血站核酸檢測工作實施方案(2013—2015年)》提出到2015年底2016初全國血液篩查基本覆蓋核酸檢測。NAT直接檢測病毒DNA/RNA, 比ELISA更早地檢出處于窗口期的標本。本調(diào)查就我站開展標本送金華血站集中化核酸檢測后HBV血清學檢測和NAT檢測結果分析比較，探討核酸檢測對降低衢州地區(qū)HBV輸血感染的意義。分析如下：

1 材料與方法

1.1標本來源收集2016年3月到2017年3月期間衢州市中心血站檢驗科檢測的獻血血液標本共27 646人份,其中首次獻血10 548人份、再次獻血17 098人份。每個獻血者同時留取兩份血液標本，分別用于ELISA檢測和核酸檢測。根據(jù)《血站技術操作規(guī)程》，核酸標本需要采集4 h內(nèi)3 500×g離心15 min并于2～8 ℃冰箱保存，標本采集后送金華血站檢測，72 h內(nèi)完成檢測，血液標本包裝盒和運送過程符合國家相關要求。

1.2方法、試劑與儀器

1.2.1 檢測方法：血液標本采集后于次日進行ELISA檢測、并將核酸管送往金華血站進行核酸檢測。ELISA檢測HBsAg采用雙抗體夾心法。NAT檢測HBV DNA引物由上海浩源生物有限公司提供，靶基因為HBV C區(qū)，反應條件：步驟一，UNG酶啟動：37 ℃×2 min，1個循環(huán)數(shù)；步驟二，UNG酶反應：50 ℃×5 min，1個循環(huán)數(shù)；步驟三，反轉錄：42 ℃×35 min，1個循環(huán)數(shù)；步驟四，核酸變性：94 ℃×10 min，1個循環(huán)數(shù)；步驟五，擴增、變性、退火、延伸：94 ℃×10 s、55 ℃×15 s、65 ℃×45 s，45個循環(huán)數(shù)(注65 ℃采集全部熒光信號)。

1.2.2 主要試劑與儀器：ELISA試劑盒：廈門英科新創(chuàng)乙肝表面抗原診斷試劑盒；英國索林乙肝表面抗原診斷試劑盒。儀器：Hamilton Star7560全自動加樣儀，F(xiàn)AME3443酶免分析儀。NAT試劑盒：上海浩源乙型肝炎病毒/丙型肝炎病毒/人類免疫缺陷病毒(1型)三合一核酸檢測試劑盒(PCR-熒光法)，本品采用儀器自動化提取，按照8的系數(shù)等體積合并檢測樣本，取1.2 ml進行核酸提取，如果檢測結果為反應性需進行拆分檢測，拆分檢測直接取需拆分標本1.2 ml進行核酸提取。儀器：ChiTas bss1200加樣提取儀；ABI7500擴增儀。

1.3判定標準ELISA檢測結果s/co值<1.0為陰性，s/co值1.0為陽性。雙試劑陰性則判定結果為陰性；單一試劑陽性，則雙孔復查，均為陰性則判斷結果為陰性，有一孔以上有陽性則判定結果為陽性；雙試劑陽性則判定結果為陽性；NAT檢測確認ELISA檢測結果，ELISA檢測陽性NAT檢測陽性則判斷ELISA結果陽性；ELISA檢測陰性NAT檢測陽性則判定ELISA結果陽性。

1.4輸血殘余風險評估方法根據(jù)“發(fā)病率/窗口期”數(shù)學模型計算公式[3-4]計算。R=ΣRi；Ri=(WFi+HFi)×Di；WFi=Ii×(Li/365)；HFi=E×Pi。R:單位血液未檢測出HBV陽性加權平均數(shù);Ri:各分組單位血液未檢測出HBV陽性數(shù)；Pi:各分組乙肝病毒現(xiàn)患率；Ii:各分組乙肝發(fā)病率；WFi:各分組窗口期風險相關因素; HFi:各分組人為因素或其他所致的試驗誤差;Di：各分組百分比;E:檢測試驗差錯率;Li:乙肝窗口期(d)；i:首次獻血組和重復獻血組。首次獻血者發(fā)病率=(重復獻血者發(fā)病率×首次獻血者現(xiàn)患率)/重復獻血現(xiàn)患率。重復獻血者發(fā)病率=重復獻血現(xiàn)患率/重復獻血間隔時間。簡化公式:R=(Li/T+E)×(ΣPi*Di)。T:重復獻血間隔時間(d)。

1.5確定參數(shù)窗口期(Li)長短與使用試劑、方法相關。根據(jù)相關文獻[4-5]確定ELISA檢測HBsAg的窗口期為59 d, NAT檢測HBV DNA的窗口期為20 d。差錯率(E)參考文獻[4,6]，本實驗室近3年參加約500份室間質(zhì)評檢測，有1份結果不符合預期，金華核酸實驗室未出現(xiàn)室間質(zhì)評結果不符合情況，故計算本實驗室的差錯率為0.2%，金華核酸實驗室的差錯率為0。重復獻血間隔時間(T),由浙江省血液中心信息中心提供為587 d。

2 結果

2.1檢測結果2016年3月至2017年3月共27 646份衢州地區(qū)無償獻血血液。HBV檢測結果為ELISA檢測陽性，NAT檢測陽性的標本有76例；ELISA檢測為陰性，NAT檢測為陽性的標本有31例；NAT檢測陽性的標本一共有107例。詳見表1。

2.2計算方法采用簡化公式R=(Li/T+E)×(ΣPi*Di)計算，ELISA檢測后HBV輸血殘余風險為28.2×10-5，NAT檢測后HBV輸血殘余風險為 13.0×10-5，NAT檢測對ELISA檢測降低輸血感染HBV殘余風險程度=(R1-R2)/R1=(28.2×10-5-13.0×10-5)/28.2×10-5=53.9%。詳見表2。

3 討論

HBV可經(jīng)輸血傳播，與病毒自身、檢測方法和受血者狀況等因素密切相關[7]。隨著獻血相關法律法規(guī)的完善以及檢測技術的革新?lián)Q代，HBV輸血傳播90%的風險來源于病毒“窗口期”[8]，當今酶免技術還不能檢出隱匿性乙肝、基因突變以及血清學轉換前的“窗口期”，而NAT直接檢測HBV-DNA，可以很大程度解決這些漏檢問題，乙肝窗口期更由原來ELISA的59 d降至20 d，大大減低窗口期給輸血帶來的風險。本次選取的27 646份無償獻血者血液標本，經(jīng)檢測乙肝總陽性率占0.39%，遠遠低于我國人群HBsAg攜帶率7．18%[1]和衢州市人群的HBsAg陽性率平均為3．21%[2],這和參加獻血人群大多是健康人群以及獻血前的健康征詢、快速試紙條的初篩有重要關系。

表1 衢州地區(qū)27 646份無償獻血血液HBV檢測情況[n(%)]

表2 2016年3月至2017年3月衢州地區(qū)無償獻血血液HBV殘余風險

很多國家使用NAT 估計來自窗口期的風險[9-10]。本分析采用“發(fā)病率/窗口期”模型[11]，將ELISA檢測陰性NAT檢測陽性的標本數(shù)看作窗口期的標本數(shù)。結果顯示NAT檢測后HBV輸血殘余風險顯著下降，符合相關報道中NAT可降低HBV輸血傳播40%～50%的殘余風險[12]。

綜合上述表明，開展核酸檢測技術能有效的降低衢州地區(qū)HBV輸血感染的殘余風險，對保證臨床輸血安全有重大意義。

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