何李英 周永明 古文鵬 許萬(wàn)福 張順先 艾琳 盧艷 田利光

510630 廣州，暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(何李英)；510623 廣州市婦女兒童醫(yī)療中心消化科(何李英、許萬(wàn)福、張順先)；650022 昆明，云南省疾病預(yù)防控制中心(周永明、古文鵬)；200025 上海，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所(張順先、艾琳、盧艷、田利光)

人杯狀病毒(Human calicivirus，HuCV)是兒童急性胃腸炎的重要病原體之一，在世界各地都有廣泛傳播，它包括諾如病毒(Norovirus，NoVs)和札如病毒(Sapovirus，SaV)。NoVs是一組小、無(wú)包膜、球形結(jié)構(gòu)的單鏈RNA病毒[1- 2]，根據(jù)叔丁基4-羥基茴香醚(BHA)多聚酶及衣殼蛋白區(qū)域序列的差異又分為六個(gè)基因群組(40個(gè)基因型)：G I、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GV和GVI，其中G I、GII和GIV群可感染人[1-2]。目前，NoVs已成為全年齡組人群急性非細(xì)菌性腹瀉的主要病原體之一，主要通過(guò)糞-口途徑傳播，臨床表現(xiàn)為低熱、惡心、嘔吐、腹痛和水樣腹瀉，嚴(yán)重者可出現(xiàn)脫水甚至死亡[3]。兒童感染NoVs后以嘔吐為主，而成人主要表現(xiàn)為短期腹瀉[3]。65歲以上人群和免疫功能缺陷患者感染NoVs后，腹瀉時(shí)間較長(zhǎng)[1]。

全球腹瀉人群中NoVs的陽(yáng)性率約為18.0%，其陽(yáng)性率在<5歲腹瀉兒童和>5歲腹瀉人群中無(wú)差異(均為18.0%)[4]。1999年以來(lái)中國(guó)開(kāi)展的<5歲兒童病毒性腹瀉原體監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示NoVs的陽(yáng)性率為8.3%～38.6%[5- 6]，在成人門(mén)診腹瀉病例中陽(yáng)性率為11.9%～26.2%[7-9]。本研究通過(guò)揭示昆明市杯狀病毒及NoVs GII的分子流行特征，為相關(guān)腹瀉疾病的防控提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1樣本來(lái)源以云南省第一人民醫(yī)院、昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、昆明市兒童醫(yī)院和昆明市普吉社區(qū)醫(yī)院為哨點(diǎn)醫(yī)院，從這4個(gè)醫(yī)院選擇腹瀉病例和對(duì)照。標(biāo)本采集獲得患者或家屬知情同意。

腹瀉病例入選標(biāo)準(zhǔn)：1)2014年7月1日至2015年6月30日，在上述4家醫(yī)院就診的<5以下兒童；2)在過(guò)去24 h內(nèi)，排便次數(shù)≥3次且形態(tài)異常；3)本次腹瀉和上次腹瀉的時(shí)間間隔超過(guò)2周。

非腹瀉人群的入選標(biāo)準(zhǔn)：1)2014年7月1日至2015年6月30，在上述4家醫(yī)院就診的<5以下兒童；2)過(guò)去2周內(nèi)沒(méi)有腹瀉癥狀；4)無(wú)其他主要的消化道疾病。

1.2樣本的采集與保存從以上4個(gè)醫(yī)院無(wú)菌采集腹瀉病例和非腹瀉研究對(duì)象的糞便樣本，固體糞便每份取5～10 g，水樣便或稀糞便每份取5～10 ml，采集的標(biāo)本放入螺口采樣盒并將置于-80 ℃。

1.3儀器與試劑主要試劑：病毒核酸提取試劑盒(Viral Nucleic Acid Extraction KitⅡ，Geneaid，中國(guó))，SuperScriptⅢ逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperScript III，Invitrogen，Carlsbad，CA)，隨機(jī)引物(Promegan，Madison，USA)、dNTP MIX、GoTaq DNA 聚合(Promega，USA)，PCR Taq Mix(大連寶生物，中國(guó))，引物(表1)由上海生工合成。主要儀器：核酸電泳及凝膠成像系統(tǒng)和PCR儀(Bio-Rad 公司，USA)。

1.4病毒核酸提取、檢測(cè)、基因分型取出凍存的糞便樣本，待自然解凍后，取0.1 g或0.1 ml糞便至1.5 ml EP管，并加入0.9 ml PBS，混勻，并制成10%懸液，8 000×g離心5 min，取上清待檢。

按說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA,采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)合成cDNA，反應(yīng)條件為：42 ℃，90 min；99 ℃，5 min；4 ℃保存。

杯狀病毒的檢測(cè)采用多重PCR法。反應(yīng)體系為25 μl：cDNA 1 μl、三對(duì)上下游引物(289H-290 K)各1 μl、2×PCR Taq Mix 12.5 μl和去離子水5.5 μl。擴(kuò)增條件為：94 ℃,5 min； 94 ℃,1 min、49 ℃，1 min、72 ℃，1 min，循環(huán)40次；72 ℃，10 min。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果，若出現(xiàn)目的條帶(331/319 bp)，對(duì)相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上通過(guò)BLAST比對(duì)以確定是否為杯狀病毒感染、及杯狀病毒的亞型和基因型。

表1 杯狀病毒RT-PCR引物

1.5分子進(jìn)化分析將測(cè)序得到的序列提交GenBank進(jìn)行Blast相似性比較與同源性分析，并與GenBank中具有代表性的NoVs序列用軟件Clustal X進(jìn)行比對(duì)。使用Mega 6.0軟件中的鄰接法，對(duì)NoVs RdRp區(qū)的基因構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析NoVs各亞型的進(jìn)化特征。

表2 腹瀉病例中NoVs GII陽(yáng)性者的特征

注：a秩和檢驗(yàn)；b卡方檢驗(yàn)

Notes：arank sum test;bchi square test

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS24.0 軟件(IBM，US)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分類資料的OR值及95%可行區(qū)間(CIs)計(jì)算采用卡方檢驗(yàn)或Fisher檢驗(yàn)；定量資料選擇t檢驗(yàn)、方差分析或K-W秩和檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1杯狀病毒及亞型在腹瀉病例和非腹瀉病例中的比較腹瀉兒童杯狀病毒陽(yáng)性者有98例(11.5%)，其中諾如病毒GII有94例(11.1%)，諾如GI有1例(0.1%),扎如病毒有3例(0.4%)。非腹瀉人群中杯狀病毒陽(yáng)性者有8例(4.7%)，其中諾如GII有8例(4.7%)，扎如和諾如GI沒(méi)有檢出。腹瀉兒童中杯狀病毒的陽(yáng)性率高于非腹瀉兒童(χ2=7.083，P=0.008)，其中，NoVs GI的陽(yáng)性率(P=0.833)和扎如病毒的陽(yáng)性率(P=0.578)在腹瀉兒童中和非腹瀉兒童中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而NoVs GII的陽(yáng)性率在腹瀉兒童中高于非腹瀉兒童(11.1%，4.7%，χ2=6.353，P=0.012)。其中GII.P3的陽(yáng)性率在腹瀉兒童中高于非腹瀉兒童P=0.036。其他基因型如GII.P、 GII.P5、 GII.P12和GII.P17的陽(yáng)性率在腹瀉兒童和非腹瀉兒童中差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2腹瀉病例中諾如病毒陽(yáng)性者特征在腹瀉兒童中NoVs GII陽(yáng)性和NoVs GII陰性的年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.398，P=0.691)，其年齡中位數(shù)均為0.92歲。NoVs GII陽(yáng)性者的腹瀉次數(shù)多于NoVs GII陰性者的腹瀉次數(shù)(χ2=9.251，P<0.001)。發(fā)熱在NoVs GII陽(yáng)性和NoVs GII陰性者中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.008，P=0.928)，嘔吐在NoVs GII陽(yáng)性者中高于NoVs GII陰性者(χ2=29.734，P=0.001)，脫水在NoVs GII陽(yáng)性者中高于NoVs GII陰性者(χ2=18.880，P=0.001)，水樣便和黏液樣便在NoVs GII陽(yáng)性者中高于NoVs GII陰者(χ2=17.920，P<0.001；χ2=15.077，P<0.001)(表2)。

2.3腹瀉病例中NoVsGII及基因型年齡分布特征將850名腹瀉兒童分成3個(gè)不同的年齡組：<1歲、1～2歲、2～5歲，其中<1歲組449人、1～2歲組269人、2～5歲有132人。NoVs GII的陽(yáng)性率在不同年齡組的腹瀉人群中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.620，P=0.733)。GII.P3的陽(yáng)性率在不同年齡組的腹瀉人群中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.680，P=0.035)。GII.P4、GII.P5、GII.P12和GII.P17的陽(yáng)性率在不同年齡組的腹瀉人群中差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 腹瀉兒童中NoVs GII及基因型年齡分布

2.4NoVsGII及基因型在腹瀉兒童中的性別分布特征NoVs GII的陽(yáng)性率在不同性別的腹瀉兒童中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.038，P=0.846)。GII.P4的陽(yáng)性率在男性腹瀉兒童和女性腹瀉兒童中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.5%，n=19；5.7%，n=24；χ2=0.637，P=0.425)，其他基因型的陽(yáng)性率在不同性別間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表4)。

表4 腹瀉人群中NoVs GII及基因型性別分布

2.5NoVsGII基因型在腹瀉兒童中的季節(jié)分布特征根據(jù)昆明市氣候特征，將2～4月定義為春季、5～7月為夏季、8～10月為秋季、11月到次年1月為冬季，分別收集到腹瀉病例180名、136名、192名和342名。腹瀉兒童中NoVs GII的陽(yáng)性率有明顯的季節(jié)趨勢(shì)(χ2=9.867，P=0.020)，流行高峰為秋季(15.6%)，低谷為冬季(7.9%)。其中，GII.P4和GII.P12的流行也有明顯的季節(jié)趨勢(shì)(χ2=8.881，P=0.031；χ2=7.917，P=0.039)，流行高峰為秋季(8.9%、5.7%)，低谷為冬季(3.2%、1.5%)。其他基因型(GII.P3、GII.P5、GII.P17)的流行沒(méi)有季節(jié)特征。

2.6NoVsGII進(jìn)化分析總共102株NoVs GII被檢出且都成功測(cè)序，選取代表性的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖1)。結(jié)果表明GII.4中GII.4_Sydney2 012株占優(yōu)勢(shì)，GII.4_2006b很少，GII.4_Orleans2 009株沒(méi)有檢出。同時(shí)也檢出GII.P17。

3 討論

HuCV是人類急性非菌性胃腸炎的主要病原體之一[1]，其中NoVs占HuCV的絕大多數(shù)。由于NoVs具有感染劑量低和缺乏持續(xù)免疫力等特點(diǎn)，人群對(duì)NoVs普遍易感，導(dǎo)致NoVs相關(guān)腹瀉經(jīng)常在醫(yī)院、療養(yǎng)院和學(xué)校等人多密集的半封閉環(huán)境中暴發(fā)[2, 4,9]，同時(shí)也引起很多散發(fā)的腹瀉病例。

本研究發(fā)現(xiàn)NoVs GII的陽(yáng)性率在腹瀉兒童中高于非腹瀉兒童，說(shuō)明NoVs GII是引起腹瀉的重要的腸道病原體之一，這與很多研究的結(jié)論相似[4]。本研究發(fā)現(xiàn)腹瀉兒童NoVs GII陽(yáng)性率為11.1%[6-7]，這與全國(guó)NoVs GII在兒童中感染水平基本一致。非腹瀉兒童中NoVs GII感染但不出現(xiàn)腹瀉癥狀可能與感染者機(jī)體免疫力較強(qiáng)、感染的病毒劑量較低等因素有關(guān)。

▲：腹瀉人群，●：健康對(duì)照?qǐng)D1 NoVs GII聚合酶區(qū)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)▲: diarrhea cases；●: healthy controlsFig.1 Phylogenetic tree of RNA polymerase region among NoV GII in Kunming City

本研究發(fā)現(xiàn)GII.P4仍是NoVs GII的優(yōu)勢(shì)基因型，而GII.4_Sydeny2012株是GII.4的優(yōu)勢(shì)株，GII.4_2006b株呈現(xiàn)低流行狀態(tài)，GII.4_Orleans_2009株并未被檢出，這與全國(guó)近年來(lái)年NoVs監(jiān)測(cè)的結(jié)果相似。與此同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)NoVs GII流行的高峰期是秋季，這與中國(guó)NoVs GII流行特征相符[7]。我國(guó)NoVs GII的流行特征和歐美地區(qū)不同，2009年歐美地區(qū)GII.4_Orleans 2009株成功取代GII.4_2006b株，并成為優(yōu)勢(shì)株；到2012年GII.4_Sydney 2012株則成功取代GII.4_Orleans 2009株成為優(yōu)勢(shì)株[6-7, 10]，盡管2014年下半年以來(lái)，GII.17基因型在廣東和江蘇等地區(qū)引起大量暴發(fā)性腹瀉事件和散發(fā)性腹瀉病例[11-12]，但在昆明GII.17并未取代GII.4成為優(yōu)勢(shì)基因型。

本研究發(fā)現(xiàn)NoVs GII在<5歲腹瀉人群流行程度較高，存在多種基因型，且以GII.P4為優(yōu)勢(shì)型別，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)新基因型GII.P17。因此，繼續(xù)加強(qiáng)對(duì)HuCV(包括NoVs GII)的病原學(xué)監(jiān)測(cè)，了解其流行型別的動(dòng)態(tài)變化，以便有效防控相關(guān)腹瀉。

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