趙方 劉曉寧 程林 徐六妹 李莎茜 蔡侃儒 何云 王輝 劉映霞

518112 深圳市第三人民醫(yī)院

結(jié)核感染是艾滋病患者常見的機(jī)會性感染和主要死因[1]。調(diào)查顯示，我國HIV/AIDS患者中合并結(jié)核的感染率為14.44 %[2]，HIV/TB雙重感染嚴(yán)重影響我國艾滋病患者預(yù)后和生存質(zhì)量。了解HIV/TB雙重感染的免疫機(jī)制,進(jìn)一步研究出新的早期診斷指標(biāo)及特異性治療靶點(diǎn)成為我國當(dāng)前艾滋病防治工作的當(dāng)務(wù)之急。

SOCS3(Suppressor of cytokine signaling-3)是JAK/STAT信號通路上的負(fù)調(diào)節(jié)因子，能夠被多種炎癥因子和抗炎因子誘導(dǎo)表達(dá)，并抑制多種免疫分子的信號傳導(dǎo)，在炎癥性疾病、病毒感染、肥胖及腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。有臨床研究表明,SOCS3的表達(dá)水平與結(jié)核的嚴(yán)重程度相關(guān)[3]，我們前期研究也發(fā)現(xiàn)HIV/TB雙重感染患者在抗病毒治療后SOCS3的表達(dá)顯著改變[4]，有待于進(jìn)一步證實(shí)。

本研究對HIV感染者、HIV/TB雙重感染者及健康對照人群血清中SOCS3及相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平進(jìn)行研究及比較，探求SOCS3在HIV/TB雙重感染免疫機(jī)制中的作用。

1 對象與方法

1.1研究對象單純HIV組(50例)： 選取2015.07～2016.03期間在我院就診HIV感染者。入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，化學(xué)發(fā)光法HIV-1抗體陽性并通過蛋白質(zhì)印跡法確認(rèn)。HIV/TB雙重感染者組(48例)入選標(biāo)準(zhǔn)：上述HIV組入選標(biāo)準(zhǔn)的患者并符合結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)：痰涂片或痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性或痰GeneXpert陽性。健康對照組(50例)：年齡≥18歲選取同期我院健康體檢者，排除近期患有感染性或自身免疫性疾病。本研究內(nèi)容均獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)和參加者的書面知情同意。

表1 研究對象的基本信息

注：N/A不適用 Note:N/A denotes not applicable

1.2研究方法

1.2.1 CD4+T細(xì)胞絕對值測定: 入選病例的50 μl EDTA抗凝血全血放置CD4+T細(xì)胞絕對計(jì)數(shù)管中，再加入20 μl CD4 /CD8 /CD3 檢測試劑、50 μl 免洗溶血素，隨后在室溫避光處放置15 min，用流式儀檢測并進(jìn)行自動分析，計(jì)數(shù)CD4+T細(xì)胞的絕對值。

1.2.2 HIV病毒載量檢測: 取200 EDTA抗凝血漿加入smart32半自動核酸提取儀，使用達(dá)安基因HIV定量檢測試劑盒測定病毒載量，全部操作按照操作說明書進(jìn)行。檢測范圍250～1×108拷貝/ml。

1.2.3 細(xì)胞因子的檢測: 采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 檢測IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、 IL-17，IL-22及SOCS3血清中的濃度，所有試劑盒均購自美國R&D公司。嚴(yán)格按照檢測試劑盒說明書操作，測定儀器為Beckman 公司DTX-880 酶標(biāo)儀。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用方差分析，SOCS3與各細(xì)胞因子間采用pearson相關(guān)分析。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1調(diào)查對象的一般人口學(xué)特征所有入組者均未接受過抗HIV治療，其中單純HIV感染者50人，HIV/TB雙重感染48人，對照組健康者50人。3組在年齡、性別構(gòu)成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.752,P=0.543)。單純HIV感染組和HIV/TB雙重感染組在病毒載量及CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.365,P=0.093)。(見表1)

2.2兩兩比較健康對照組、單純HIV感染組及HIV/TB雙重感染組中SOCS3和其他相關(guān)細(xì)胞因子水平SOCS3和IL-6在HIV/TB雙重感染者的水平明顯高于健康對照組及單純HIV感染組(P<0.01),但在健康對照和單純HIV感染兩組間無明顯差別(P>0.05，見圖1 A、E)。IFN-γ、IL-2在單純HIV組和HIV/TB雙重感染者的水平明顯低于健康對照組及(P<0.01，見圖1B、C)。 IL-4、IL-10的濃度從對照組、HIV組、HIV/TB雙重感染組逐步升高，且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1D、1F)。對照組健康者IL-17的水平明顯高于HIV組和HIV/TB雙重感染組,但兩個(gè)感染組之間卻差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見圖1G)。IL-22在HIV組中的水平要低于健康組，同時(shí)也低于HIV/TB雙重感染組(P<0.01，見圖1H)。

2.3SOCS3與其他細(xì)胞因子相關(guān)性分析由表2各因素相關(guān)分析可見SOCS3在HIV/TB組中與其他細(xì)胞因子的相關(guān)性較好，其中與IFN-γ、IL-4、IL-6、IL-10、IL-22顯著相關(guān)(P<0.01)。在健康對照組中SOCS3與IFN-γ、IL-17、IL-22顯著相關(guān)(P<0.01)。而在HIV組中沒有發(fā)現(xiàn)與SOCS3顯著相關(guān)的細(xì)胞因子。

表2 健康對照、單純HIV感染、 HIV/TB雙重感染三組中SOCS3與其他細(xì)胞因子的相關(guān)性分析

圖1 健康對照、單純HIV感染者、 HIV/TB雙重感染者血清細(xì)胞因子水平的比較(*P<0.05，**P<0.01)Fig.1 Comparisons of cytokine levels among HIV, HIV/TB patients and healthy controls

3 討論

結(jié)核病和艾滋病二者合并感染能夠相互影響、相互促進(jìn)，導(dǎo)致較高發(fā)病率和死亡率。HIV及TB的感染及發(fā)病均涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子變化，細(xì)胞因子在機(jī)體的抗感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。較多的研究表明，Th1/Th2平衡紊亂及Th17細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)相關(guān)細(xì)胞因子分泌調(diào)節(jié)失衡是導(dǎo)致艾滋病結(jié)核易感產(chǎn)生的主要原因[5,6]。

大多數(shù)細(xì)胞因子利用酪氨酸激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(JAK-STAT)傳導(dǎo)信號，SOCS3作為JAK/STAT信號通路上的負(fù)調(diào)節(jié)因子，可調(diào)控IFN-γ、IL-1、IL-2、TNF-α、生長激素等多種細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與人體免疫反應(yīng)。我們前期通過對HIV/TB雙重感染患者的外周血單核細(xì)胞(PBMC)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析, 發(fā)現(xiàn)HIV/TB雙重感染患者在進(jìn)行高效抗逆轉(zhuǎn)錄酶治療(HAART)后SOCS3基因表達(dá)顯著改變，提示SOCS3分子有可能是HIV/TB雙重感染者體內(nèi)的重要免疫調(diào)節(jié)分子[4]。本研究通過對臨床樣本的進(jìn)一步調(diào)查，發(fā)現(xiàn)SOCS3在HIV/TB雙重感染者的水平明顯高于健康對照組和單純HIV組，與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道SOCS在結(jié)核病中的表達(dá)升高相符。但同時(shí)發(fā)現(xiàn)SOCS3在健康對照組及單純HIV組之間并無明顯差異，提示SOCS3的升高主要與結(jié)核感染相關(guān)，受HIV感染的影響較小，對于HIV/TB雙重感染的診斷有潛在的價(jià)值。

SOCS3作為細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對于Th1/Th2平衡發(fā)揮發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。 在一些炎癥性疾病中，SOCS3通過干擾TLR和IFN-γ介導(dǎo)的STAT通路，抑制Th1細(xì)胞分化[7]。另外，IL-6、IL-4可誘導(dǎo)SOCS3抑制IFN-γ的分泌，但SOCS3卻不反饋抑制IL-4，從而促進(jìn)Th2細(xì)胞功能活化[8]。我們的研究中，HIV/TB雙重感染患者Th1細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2水平下降，而Th2細(xì)胞因子IL-4及IL-6上升，支持Th1細(xì)胞功能向Th2轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致Th1/Th2失衡。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HIV/TB雙重感染患者的IFN-γ、IL-2下降程度比單純HIV感染要更加大，提示Th1/Th2失衡是由HIV感染和結(jié)核感染共同導(dǎo)致。

Th17與Treg的平衡在艾滋病和結(jié)核病的發(fā)病進(jìn)展中具有重要作用[9-12]。研究也發(fā)現(xiàn)SOCS3可以促進(jìn)Th17分泌IL-17和IL-22[13]。文獻(xiàn)報(bào)道，在單純結(jié)核感染中，Th17功能增強(qiáng)，血清中IL-17和IL-22表達(dá)水平升高[14]。而艾滋病患者細(xì)胞免疫功能缺陷，CD4+IL-17+T淋巴細(xì)胞顯著下降，因而對于抵抗結(jié)核的保護(hù)性免疫減弱，從而增強(qiáng)了艾滋病患者的結(jié)核易感性。我們研究中HIV感染者及HIV/TB雙重感染患者IL-17均下降與先前報(bào)道相符[15]，也進(jìn)一步解釋了為何在HIV/TB雙重感染患者中SOCS3升高，而IL-17和IL-22卻沒有相應(yīng)升高的原因。

SOCS3是機(jī)體免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵蛋白，與許多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)密切相關(guān)，我們實(shí)驗(yàn)中的相關(guān)性研究也發(fā)現(xiàn)SOCS3與IFN-γ、IL-6、IL-17、IL-22等細(xì)胞因子的水平顯著相關(guān)。但由于本研究未加入單純結(jié)核組作為對照，不能夠進(jìn)一步了解SOCS3在單純結(jié)核感染和HIV/TB雙重感染之間是否存在差異，有待于今后進(jìn)一步研究?？傊?，我們的研究表明，SOCS3在HIV/TB雙重感染中顯著性增高，與機(jī)體免疫反應(yīng)密切相關(guān)。SOCS3有望成為HIV/TB合并感染診斷的分子指標(biāo)。另外，繼續(xù)深入研究該分子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及其在HIV/TB合并感染的作用，將為以SOCS3作為靶標(biāo)的結(jié)核治療策略奠定理論基礎(chǔ)。

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