周燕芳++鄭榮彬

摘要：以鳙魚(yú)（Aristichthysnobilis）魚(yú)肉蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶對(duì)鳙魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，制備具有抗氧化活性的可溶性肽。研究酶濃度、底物濃度、溫度、時(shí)間、pH對(duì)水解度和DPPH·自由基清除率的影響。通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，酶解的最佳條件是酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，溫度60 ℃，酶解2 h，pH 7.0，在此條件下，所得可溶性肽的活性最高，對(duì)DPPH·自由基的清除率為69.09%，對(duì)羥自由基的清除率為75.22%，對(duì)O2-·自由基的清除率為61.92%。

關(guān)鍵詞：鳙魚(yú)（Aristichthysnobilis）蛋白；木瓜蛋白酶；控制酶解；自由基；清除率

中圖分類(lèi)號(hào)：TS254.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）01-0115-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.029

Study on Preparation of Active Peptide with Bighead Carp Protein by Enzymolysis

ZHOU Yan-fang，ZHEN Rong-bin

（School of Chemical and Environmental Engineering，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Abstract：Using bighead carp（Aristichthysnobilis） protein as materials，the preparation of active peptide from bighead carp protein by enzymatic hydrolysis with papain was studied. The effects of enzyme concentration， substrate concentration，temperature，time and pH value on the degree of hydrolysis and removal of DPPH-free radical were studied. By orthogonal design， the results showed that when the enzyme concentration was 1 400 U/g， and the substrate concentration was 3.0%， temperature was 60 ℃， enzymatic hydrolysis time was 2 h， pH was 7. The scavenging rate of DPPH· free radical reached 69.09%，the removal rate of ·OH and O2-· reached 75.22% and 61.92%.

Key words：bighead carp（Aristichthysnobilis） protein；papaya；controlled-enzymatic hydrolysis；free radicals；antioxidant ability

鳙魚(yú)（Aristichthysnobilis）又叫花鰱、胖頭魚(yú)、包頭魚(yú)等。鳙魚(yú)的生長(zhǎng)速度比鰱魚(yú)快，是較宜養(yǎng)殖的優(yōu)良魚(yú)種之一，為中國(guó)主要的淡水養(yǎng)殖魚(yú)之一。由于傳統(tǒng)消費(fèi)習(xí)慣的原因，人們對(duì)鳙魚(yú)頭有特別的嗜好，造成魚(yú)身和魚(yú)尾部分價(jià)格大跌，再加上鳙魚(yú)具有土腥味，造成大量魚(yú)肉低價(jià)售賣(mài)，甚至作為飼料，造成極大的浪費(fèi)。

關(guān)于鳙魚(yú)研究，國(guó)內(nèi)目前主要集中在鳙魚(yú)的養(yǎng)殖、魚(yú)病防治等方面，對(duì)其深加工研究較少，且涉及加工的主要集中在傳統(tǒng)加工產(chǎn)品如冷凍魚(yú)、煙熏魚(yú)、魚(yú)干等，如熊光權(quán)等[1]進(jìn)行了以鳙鰱魚(yú)為原料制備魚(yú)肉香腸的研究，青島海洋大學(xué)通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)鳙魚(yú)屬于凝膠形成困難、凝膠劣化容易的魚(yú)種，不適宜加工為魚(yú)糜制品[2]，必須尋求新的途徑來(lái)提高其附加值。水產(chǎn)保健食品作為一種有較長(zhǎng)生命力的產(chǎn)品，不僅產(chǎn)品附加值高，而且原料不受冰凍影響，生產(chǎn)不受季節(jié)限制。目前，市場(chǎng)上已出現(xiàn)一些利用牡蠣、螺旋藻、魚(yú)子、魚(yú)油等生產(chǎn)的保健食品，而水產(chǎn)活性肽制品則相對(duì)較少，且主要集中在海洋生物肽產(chǎn)品方面[3]，鮮見(jiàn)以鳙魚(yú)為原料開(kāi)發(fā)保健食品的研究。通過(guò)控制酶解，魚(yú)肉中呈惰性的生物活性肽被釋放出來(lái)，表現(xiàn)出抗氧化、促進(jìn)鈣質(zhì)吸收、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)肉芽增生從而加速傷口愈合等生理功效[4]。因此，結(jié)合中國(guó)的具體情況，選擇蛋白質(zhì)含量高，但利用率不高或生物價(jià)不高的廉價(jià)魚(yú)作為原料，通過(guò)酶解等生物手段，制備活性肽，為鳙魚(yú)的深加工提供一條新途徑，增加經(jīng)濟(jì)效益。本研究以鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白為原料，采用木瓜蛋白酶對(duì)鳙魚(yú)蛋白進(jìn)行酶解，制備具有抗氧化活性的可溶性肽，以期為鳙魚(yú)的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鳙魚(yú)購(gòu)買(mǎi)于廣東省潮州市南橋市場(chǎng)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·自由基）購(gòu)于Sigma公司；木瓜蛋白酶（BR，酶活力5萬(wàn)U/g）購(gòu)于江西銳陽(yáng)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器

KW1000DC型電熱恒溫水浴鍋（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；AUY220型分析天平（日本島津公司）；KDN-103F型定氮儀（上海纖檢儀器有限公司）；101-2AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；PHS-3C型精密級(jí)數(shù)字式酸度計(jì)（上海手術(shù)器械廠）；TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 方法

1.3.1 指標(biāo)測(cè)定 蛋白質(zhì)的測(cè)定采用微量凱氏定氮法[5]；游離氨基酸的測(cè)定采用雙指示劑甲醛滴定法[6]；總氮量的測(cè)定采用微量凱氏定氮法[5]；水解度的計(jì)算：水解度=（水解產(chǎn)生游離氨基酸態(tài)氮量/原料總氮含量）×100%[7]，其中水解產(chǎn)生游離氨基態(tài)氮量=水解后酶解液中的游離氨基氮-原料中的游離氨基氮。

多肽活性的測(cè)定：DPPH·自由基清除率的測(cè)定參考文獻(xiàn)[8]，·OH自由基清除效果的測(cè)定參考文獻(xiàn)[9]，O2-·自由基清除效果的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]。

1.3.2 鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解工藝 將鳙魚(yú)去鱗、去魚(yú)皮，魚(yú)肉蒸熟，去魚(yú)骨，在電熱鼓風(fēng)機(jī)干燥，粉碎，脫脂得到鳙魚(yú)蛋白粉，下稱(chēng)“魚(yú)粉”。稱(chēng)取適量鳙魚(yú)蛋白粉，加入一定比例的去離子水，勻漿后調(diào)整pH，加入一定量的木瓜蛋白酶于反應(yīng)溶液中，攪拌均勻，置于恒溫水浴鍋中進(jìn)行酶解。反應(yīng)至預(yù)定時(shí)間后，將其迅速水浴加熱10 min使酶失活，進(jìn)行抽濾，得到濾液，進(jìn)行相關(guān)測(cè)定。

1.3.3 單因素試驗(yàn)對(duì)鳙魚(yú)蛋白制備活性肽的影響 分別對(duì)酶濃度、底物濃度、溫度、時(shí)間、pH等因素進(jìn)行研究，考察各因素對(duì)水解度及DPPH·自由基的清除率的影響。

1）酶濃度的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量魚(yú)粉，加入一定量去離子水，配制成濃度為2.0%的魚(yú)糜液，在溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時(shí)間4 h，酶濃度是1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 U/g。

2）底物濃度的影響。準(zhǔn)確稱(chēng)取一系列不同質(zhì)量的魚(yú)粉，分別加入一定量去離子水，配制成底物濃度為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的魚(yú)糜液，在60 ℃下，溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時(shí)間4 h，酶濃度是1 800 U/g進(jìn)行酶解。

3）時(shí)間的影響。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量魚(yú)粉，加入一定量的去離子水，配制成底物濃度為3.0%的魚(yú)糜液，在60 ℃下，酶濃度是1 800 U/g，溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h進(jìn)行酶解。

4）溫度的影響。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量魚(yú)粉，加入一定量的去離子水，配制成底物濃度為3.0%的魚(yú)糜液，在酶濃度是1 800 U/g，溫度為60 ℃，pH為7的條件下，酶解時(shí)間4 h，酶解溫度分為45、50、55、60、65、70 ℃進(jìn)行酶解。

5）pH的影響。分別準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量魚(yú)粉，加入一定量的去離子水，配制成底物濃度為3.0%的魚(yú)糜液，在60 ℃下，酶濃度是1 800 U/g，溫度為60 ℃，酶解時(shí)間為4 h，酶解的pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5進(jìn)行酶解。

各單因素試驗(yàn)酶解后抽濾，測(cè)定水解度和對(duì)DPPH·自由基的清除率。

1.3.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化鳙魚(yú)肉蛋白活性肽制備條件 綜合各單因素試驗(yàn)結(jié)果，以酶濃度、底物濃度、時(shí)間、溫度、pH 5個(gè)因素進(jìn)行5因素4水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同酶濃度對(duì)鳙魚(yú)肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從圖1可知，隨著酶濃度的增大，水解度和DPPH·清除率均有所增加，當(dāng)酶濃度從1 000 U/g增加到1 600 U/g時(shí)，隨著酶濃度的增高，鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白被木瓜蛋白酶逐步水解，多肽逐漸形成，水解度和DPPH·清除率均增加，但當(dāng)酶濃度高于1 600 U/g時(shí)，隨著酶濃度的增高，多肽被木瓜酶進(jìn)一步水解，水解度略有增加，而DPPH·清除率也有所下降；雖然酶濃度為1 800 U/g時(shí)，水解度達(dá)到最高點(diǎn)，但DPPH·清除率反而有所下降，這可能是由于多肽進(jìn)一步水解為氨基酸。為了得到活性較高的多肽，選擇酶濃度為1 600 U/g。

2.1.2 不同底物濃度對(duì)鳙魚(yú)肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從2圖可知，底物濃度對(duì)木瓜蛋白酶水解鳙魚(yú)具有一定影響。隨著底物濃度的增加，鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的水解度隨之下降，而DPPH·清除率呈上升的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵诘孜餄舛刃∮?.5%時(shí)，隨底物濃度的增多，鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白被木瓜蛋白酶逐步水解，多肽逐漸形成，故DPPH·清除率呈上升趨勢(shì)，雖然蛋白質(zhì)分解為多肽的量有所增加，但底物濃度的增加使總氮量大量增加，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于分解為多肽的增加量，故水解度下降；當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.0%時(shí)，其DPPH·清除率為最高值，而當(dāng)?shù)孜餄舛却笥?.0%時(shí)，蛋白質(zhì)的分解受到酶濃度的限制，其DPPH·清除率變化較小，故為獲得活性較大的多肽，在酶解過(guò)程中底物濃度控制在3.0%左右比較合適。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)鳙魚(yú)肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從圖3可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率和水解度緩慢增大，在1～3 h增幅明顯，在3 h后其DPPH·清除率變化不大。這可能是由于酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，鳙魚(yú)蛋白被逐步酶解，多肽逐漸形成，水解度上升，1～3 h可能是具有DPPH·清除活性的多肽大量生成的時(shí)間，從而表現(xiàn)出DPPH·清除率的明顯升高，3 h之后DPPH·清除率變化趨于平穩(wěn)，因此從經(jīng)濟(jì)方面考慮，酶解時(shí)間控制在3 h左右比較合適。

2.1.4 酶解溫度對(duì)鳙魚(yú)肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 從圖4可知，酶解溫度對(duì)酶解過(guò)程有一定的影響。隨著溫度的升高，鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白酶解產(chǎn)物的水解度和DPPH·逐漸升高，在45～60 ℃增幅明顯，在該區(qū)間，隨著溫度的升高，酶的活性增加，鳙魚(yú)蛋白被酶解生成的肽增多，水解度和DPPH·清除率均增多；溫度為60 ℃時(shí)，酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·清除率達(dá)到最高值，水解度也達(dá)到最高；溫度大于60 ℃時(shí)，隨著溫度的增加，水解度和DPPH·清除率均有所下降，可能是溫度升高使得部分酶失活，故選擇溫度為60 ℃比較合適。

2.1.5 pH對(duì)鳙魚(yú)肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影響 pH對(duì)鳙魚(yú)肉蛋白水解度和DPPH·清除率的影響見(jiàn)圖5。從圖5可知，隨著pH的增大，水解度和DPPH·清除率均有所增加，從水解度的曲線(xiàn)來(lái)看，pH為7.0時(shí)酶的活性最高；pH為6.0～7.0時(shí)，隨pH的增加，酶的活性增大，故水解度呈上升趨勢(shì)；當(dāng)pH大于7.0時(shí)，隨著pH的增加，酶的活性降低，故水解度呈下降趨勢(shì)。對(duì)于DPPH清除率，隨著pH增加，酶的活性先增大后減小，在pH為7.5時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到峰值。為了得到活性較大的多肽，故選擇pH為7.0。

2.2 正交試驗(yàn)法優(yōu)化酶解條件

以溫度、時(shí)間、底物濃度、酶濃度、pH為自變量，以DPPH·清除率為指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)分析。結(jié)果如表2所示。由表2可知，影響木瓜蛋白酶酶解鳙魚(yú)蛋白制備抗氧化肽工藝的主次順序?yàn)锳>C>E>D>B，即溫度>底物濃度>pH>酶濃度>時(shí)間。各因素的最優(yōu)組合為A3B1C3D1E3，即酶濃度為1 400 U/g，底物濃度為3.0%，酶解時(shí)間為2 h，溫度為60 ℃，pH為7.0，對(duì)該條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的結(jié)果是DPPH·自由基清除率為69.09%，均大于正交試驗(yàn)結(jié)果。鳙魚(yú)酶解的最佳條件為酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，酶解時(shí)間2 h，溫度60 ℃，pH 7.0。

2.3 最佳條件下所得活性肽的活性測(cè)定

在最佳條件下即酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，酶解時(shí)間為2 h，pH 7.0，溫度60 ℃進(jìn)行酶解，得到活性多肽，其DPPH·自由基清除率為69.09%，對(duì)·OH自由基清除率為75.22%，對(duì)O2-·自由基清除率為61.92%。

3 小結(jié)

本研究以鳙魚(yú)魚(yú)肉蛋白為原材料，以水解度和抗氧化活性為指標(biāo)，研究了木瓜蛋白酶制備鳙魚(yú)蛋白活性肽的最佳工藝，選用木瓜蛋白酶對(duì)鳙魚(yú)魚(yú)肉進(jìn)行酶解，制備抗氧化肽，通過(guò)對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行水解度和DPPH·清除率的測(cè)定，并以DPPH·清除率為主要指標(biāo)。在酶解的單因素試驗(yàn)證實(shí)溫度、時(shí)間、底物濃度、酶濃度、pH對(duì)木瓜蛋白酶水解鳙魚(yú)蛋白有明顯影響。采用正交試驗(yàn)法，對(duì)各因素進(jìn)行最優(yōu)組合，得到木瓜蛋白酶酶解鳙魚(yú)蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝為酶濃度1 400 U/g，底物濃度3.0%，酶解時(shí)間2 h，pH 7.0，溫度60 ℃，測(cè)得DPPH·自由基清除率為69.09%，·OH自由基清除率為75.22%，O2-·自由基清除率為61.92%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 熊光權(quán)，葉麗秀，何建君.淡水魚(yú)魚(yú)香腸的研制[J].中國(guó)水產(chǎn)，1998（6）：18-19.

[2] 段振華，張 懋，湯 堅(jiān).鳙魚(yú)的開(kāi)發(fā)利用研究[J].科學(xué)養(yǎng)魚(yú)，2005（2）：6-7.

[3] 胡凌飛.淺談我國(guó)水產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1999，25（1）：61-64.

[4] GILL I，LOPAEZ-FANINO R，JORDN X，et al. Biological active peptides and enzymatic approach to their production[J].Enzyme and Microbial Technology，1996，18：162-183.

[5] GB 5009.6-1985，食品衛(wèi)生理化檢驗(yàn)[S].

[6] 涂宗財(cái)，陳劍兵，劉 偉，等.酶解魚(yú)鱗膠制備小分子多肽的研究[J].食品科學(xué)，2005，26（8）：210-212.

[7] 陳 晶，熊善柏，李 潔，等.白鱗魚(yú)骨蛋白酶水解工藝研究[J].食品科學(xué)，2006，27（11）：326-330.

[8] WU H C，CHEN H M，SHIAU C Y.Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties in protein hydrolysates of mackerel（Scomber austriasicus）[J].Food Research International，2003，36：949-957.

[9] HALLIWELL B.The deoxyribosemethod：A simple of“Test-tube” assay for determination of rate constants for reactions hydroxyl radicals[J].Analyt Biochem，1987，165（2）：215-219.

[10] MARKLUND S，MARKLUND G. Involvement of the superoxide anion radicals in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase[J].Eur J Biochem，1974， 47（4）：469-474.