張德福,趙禹宗,張 明,儀淑敏,趙文竹,湯軼偉,李 春,勵(lì)建榮,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071;3.渤海大學(xué)數(shù)理學(xué)院,遼寧錦州 121013)

添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR方法快速檢測(cè)食品中的阪崎克羅諾桿菌

張德福1,2,趙禹宗1,張 明1,儀淑敏1,趙文竹1,湯軼偉1,李 春3,勵(lì)建榮1,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所,病原微生物生物安全國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100071;3.渤海大學(xué)數(shù)理學(xué)院,遼寧錦州 121013)

為了解決常規(guī)PCR方法檢測(cè)阪崎克羅諾桿菌時(shí)因檢測(cè)過(guò)程中環(huán)境和食品理化因素的影響而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果的產(chǎn)生,本研究以細(xì)菌16S rRNA基因?yàn)閿U(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)照,以阪崎克羅諾桿菌特異性基因grxB為靶基因設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,并通過(guò)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,最終建立了一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的阪崎克羅諾桿菌PCR檢測(cè)方法,可以指示PCR過(guò)程中因存在DNA聚合酶抑制劑而導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。通過(guò)對(duì)20種細(xì)菌進(jìn)行PCR檢測(cè)顯示,該方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌具有良好的特異性。靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,該檢測(cè)方法對(duì)阪崎克羅諾菌純DNA模板的檢測(cè)靈敏度為2.15×102fg/μL,對(duì)阪崎克羅諾桿菌純培養(yǎng)物的檢測(cè)靈敏度為9.4×103CFU/mL。對(duì)人工污染嬰幼兒奶粉的檢測(cè)結(jié)果顯示,阪崎克羅諾桿菌接種量為0.94 CFU/g的嬰幼兒奶粉樣品經(jīng)過(guò)8 h增菌培養(yǎng)后,即可檢出。食品樣品檢測(cè)結(jié)果表明,不添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR檢測(cè)方法中出現(xiàn)的假陰性結(jié)果可被本方法檢出。該檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度較高,能消除阪崎克羅諾桿菌常規(guī)PCR檢測(cè)方法中可能出現(xiàn)的假陰性結(jié)果,適用于嬰幼兒配方乳粉、乳制品等食品中阪崎克羅諾桿菌的快速檢測(cè)。

阪崎克羅諾桿菌,擴(kuò)增內(nèi)標(biāo),假陰性,PCR檢測(cè)

阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)(舊稱(chēng)阪崎腸桿菌)是嬰幼兒配方奶粉中發(fā)現(xiàn)的一種能夠引起嬰幼兒死亡的腸桿菌科條件致病菌[1-3]。目前研究發(fā)現(xiàn),阪崎克羅諾桿菌廣泛存在于多種食品中[4-5],如奶制品[6]、肉制品[7]、蔬菜[8]、水果[9]、谷類(lèi)[10]等。在某些情況下,由阪崎克羅諾桿菌引發(fā)疾病而導(dǎo)致的死亡率可達(dá)40%～80%[11-12]。因此,加強(qiáng)對(duì)阪崎克羅諾桿菌的檢測(cè)對(duì)保障食品安全非常重要。目前,阪崎克羅諾桿菌傳統(tǒng)的培養(yǎng)——生化鑒定法比較復(fù)雜、檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度低,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代對(duì)快速檢測(cè)的要求[13]。基于PCR方法的快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)、適合高通量操作等優(yōu)點(diǎn),而成為快速檢測(cè)時(shí)的常用方法。研究表明,采用PCR檢測(cè)方法對(duì)食品樣品中的致病菌進(jìn)行實(shí)際檢測(cè)時(shí),會(huì)受到環(huán)境因素和食品理化性質(zhì)的影響,其中食品基質(zhì)復(fù)雜、培養(yǎng)基成分和DNA提取試劑殘留等原因都會(huì)影響檢測(cè)準(zhǔn)確性,造成假陰性結(jié)果。研究表明,添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)于食品樣品中致病菌PCR檢測(cè)方法體系中確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性具有重要的作用,一個(gè)有效、適用的食源性致病菌快速檢測(cè)方法必須包含能夠指示假陰性結(jié)果的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)(Internal Amplification Control,IAC)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)PCR反應(yīng)體系中采用16S rRNA基因的通用引物27F和1492R作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)引物,若被檢測(cè)樣品中含有任意細(xì)菌DNA,即可在電泳結(jié)果中觀察到一條大小為1500 bp的電泳條帶,不需要添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)片段,就可以達(dá)到指示假陰性結(jié)果的目的。在反應(yīng)體系中,若食品樣品未受到阪崎克羅諾桿菌污染,應(yīng)有擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)片段的擴(kuò)增產(chǎn)物。而當(dāng)PCR反應(yīng)沒(méi)有產(chǎn)生任何擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí),說(shuō)明反應(yīng)可能受到了抑制,產(chǎn)生了假陰性,需重新處理待檢食品樣品。

谷氧還蛋白2(Glutaredoxin 2,GrxB)是腸桿菌體內(nèi)一類(lèi)對(duì)谷胱甘肽起氧化還原作用的蛋白質(zhì),研究人員通過(guò)將阪崎克羅諾桿菌與其他細(xì)菌grxB基因序列比對(duì)及特異性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),grxB基因?qū)嫫榭肆_諾桿菌具有很強(qiáng)的特異性[16-17]。因此,本研究以grxB作為檢測(cè)靶基因設(shè)計(jì)引物,以16S rRNA序列作為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo),建立了一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的阪崎克羅諾桿菌PCR檢測(cè)方法,并從特異性、純DNA和純培養(yǎng)物靈敏度、人工污染嬰幼兒奶粉樣品以及食品樣品實(shí)際檢測(cè)四個(gè)方面對(duì)該檢測(cè)方法進(jìn)行了評(píng)價(jià)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)用菌株阪崎克羅諾桿菌(ATCC 29004、ATCC 29544)、大腸桿菌O157∶H7(ATCC 43889)、腐敗希瓦氏菌(ATCC 8071)、銅綠假單胞菌(ATCC 9027)、副溶血弧菌(ATCC 33847)、粘質(zhì)沙雷氏菌(ATCC 14041)和地衣芽孢桿菌(ATCC 14580) 購(gòu)自美國(guó)模式菌種保藏中心；福氏志賀氏菌(CMCC(B)51572)、金黃色葡萄球菌(CMCC(B)26001)、沙門(mén)氏菌(CMCC(B)50041)及蠟樣芽胞桿菌(CMCC 63301) 均購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心;單增李斯特菌(ATCC 19115) 由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院方維煥教授贈(zèng)送;魯氏耶爾森氏菌、哈維弧菌、河流弧菌、溫和氣單胞菌、創(chuàng)傷弧菌、溶藻弧菌、嗜水氣假單胞菌和熒光假單胞菌 由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定、保存;人工污染及實(shí)際檢測(cè)用的新鮮肉、嬰幼兒奶粉、水產(chǎn)品、豆制品、雞蛋、乳制品等6類(lèi)共51份樣品 均采購(gòu)自本地商場(chǎng)；Taq-PCR Master Mix、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA Marker D2000 生工生物工程(上海)股份有限公司；LB等培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖 Sigma公司。

DYY-8C型電泳儀 北京市六一儀器廠;LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;Mastercycler pro梯度PCR儀、5424R冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司;Cheimd Doc XRS型凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司;NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司;DL-CJ-2N型超級(jí)潔凈工作臺(tái) 東聯(lián)哈爾(北京)儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 阪崎克羅諾桿菌的培養(yǎng)及DNA的提取 將實(shí)驗(yàn)室冷凍保存的阪崎克羅諾桿菌接種于LB平板上活化后,采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA,經(jīng)NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度為2.15×102ng/μL,置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 特異性引物的設(shè)計(jì)和篩選 選擇阪崎克羅諾桿菌特異性基因grxB(GenBank:FN543093.2)作為靶基因,利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物,經(jīng)PCR反應(yīng)驗(yàn)證篩選出一對(duì)特異性良好的阪崎克羅諾桿菌檢測(cè)引物:grxBF/grxBR。采用細(xì)菌16S rRNA擴(kuò)增通用引物27F和1492R作為PCR反應(yīng)內(nèi)標(biāo)對(duì)照引物。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示。

表1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.2.3 PCR檢測(cè)方法的建立 根據(jù)TaqPCR Master Mix說(shuō)明書(shū)所建議的PCR反應(yīng)體系對(duì)PCR反應(yīng)體系的各組分含量以及擴(kuò)增程序進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整,最終確定PCR反應(yīng)最佳條件為:總體系25 μL,其中TaqPCR Master Mix 12.5 μL,DNA模板2 μL,10 μmol/L的引物27F/1492R和grxBF/grxBR各1 μL,補(bǔ)充無(wú)菌水至25 μL。以無(wú)菌水作為空白對(duì)照。

PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min后進(jìn)行35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性30 s、61.6 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s,最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳,使用EB染色后置于凝膠成像儀下觀察結(jié)果。

1.2.4 特異性驗(yàn)證 使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取表1中細(xì)菌的基因組DNA,并用建立的含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR檢測(cè)方法對(duì)所有細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè),驗(yàn)證該方法的特異性。

1.2.5 靈敏度評(píng)價(jià)

1.2.5.1 純DNA靈敏度評(píng)價(jià) 將提取的阪崎克羅諾桿菌基因組DNA用無(wú)菌去離子水進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,使用建立的PCR檢測(cè)方法對(duì)濃度為1～106fg/μL的DNA溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果中能得到肉眼可見(jiàn)大小為333 bp條帶的最低濃度DNA溶液,視為該P(yáng)CR檢測(cè)方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌的純基因組DNA檢測(cè)靈敏度。

1.2.5.2 純培養(yǎng)物靈敏度評(píng)價(jià) 將活化的阪崎克羅諾桿菌于37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h后,用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列梯度稀釋,取適當(dāng)濃度的菌懸液傾倒平板計(jì)數(shù),每個(gè)稀釋度再取1 mL置于1.5 mL離心管中,用試劑盒提取基因組DNA,作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,檢測(cè)該方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌純培養(yǎng)物的靈敏度。

1.2.6 人工污染食品樣品實(shí)驗(yàn) 無(wú)菌操作取10份嬰幼兒奶粉,每份10 g,接種適當(dāng)稀釋濃度的阪崎克羅諾桿菌菌液1 mL,使奶粉中的菌液濃度分別為0～1、1～10、10～100 CFU/g,每組做3個(gè)平行,另取一份加入無(wú)菌生理鹽水做為空白對(duì)照。分別將人工污染的奶粉樣品加入到90 mL LB液體培養(yǎng)基中,混勻后37 ℃振蕩培養(yǎng),每隔2 h取1 mL菌液置于1.5 mL離心管中,用試劑盒提取基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。

1.2.7 食品樣品檢測(cè) 新鮮肉、嬰幼兒奶粉、水產(chǎn)品、豆制品、雞蛋、乳制品等樣品每份取25 g或25 mL。鮮肉、水產(chǎn)品及豆制品樣品加入到盛有225 mL LB培養(yǎng)基的無(wú)菌袋中均質(zhì)2 min,嬰幼兒奶粉、雞蛋及乳制品直接與225 mL LB培養(yǎng)基混勻,37 ℃振蕩培養(yǎng)10 h后提取基因組DNA,并用建立的添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)。所有樣品同時(shí)根據(jù)GB 478940-2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 阪崎腸桿菌檢驗(yàn)》的方法進(jìn)行阪崎克羅諾桿菌的確認(rèn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性驗(yàn)證

PCR檢驗(yàn)結(jié)果如圖1所示,只有阪崎克羅諾桿菌基因組DNA能全部擴(kuò)增出大小為333 bp的檢測(cè)條帶和大小為1500 bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)照條帶,而其它細(xì)菌基因組DNA只能擴(kuò)增出大小為1500 bp的擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)照條帶。表明實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)建立的PCR檢測(cè)方法特異性良好。

圖1 阪崎克羅諾桿菌特異性試驗(yàn)Fig.1 Agarose(1%)gel electrophoresis of DNA productsamplified from Cronobacter sakazakii and non-Cronobacter species by PCR using the primers注：M：D2000 DNA marker；1：副溶血性弧菌；2：大腸桿菌O157∶H7；3：腸炎沙門(mén)氏菌；4：福氏志賀氏菌；5：?jiǎn)卧隼钏固鼐?：蠟樣芽孢桿菌；7：阪崎克羅諾桿菌；8：金黃色葡萄球菌；9：腐敗希瓦氏菌；10：銅綠假單胞菌；11：粘質(zhì)沙雷氏菌；12：嗜水氣單胞菌；13：溫和氣單胞菌；14：熒光假單胞菌；15：地衣芽孢桿菌；16：魯氏耶爾森氏菌；17：哈維弧菌；18：溶藻弧菌；19：創(chuàng)傷弧菌；20：河流弧菌。

2.2 靈敏度評(píng)價(jià)

2.2.1 純DNA靈敏度實(shí)驗(yàn) 如圖2所示,阪崎克羅諾桿菌基因組DNA經(jīng)10倍梯度稀釋至2.15×102fg/μL時(shí),PCR檢測(cè)結(jié)果仍有肉眼可見(jiàn)條帶,表明阪崎克羅諾桿菌基因組DNA的檢測(cè)靈敏度為2.15×102fg/μL。

圖2 阪崎克羅諾桿菌基因組DNA檢測(cè)靈敏度Fig.2 Agarose gel electrophoresis showing sensitivity of detection of the PCR amplified Cronobacter sakazakii genomic DNA from various concentrations注：M：D2000 DNA ladder marker；1～7：阪崎克羅諾桿菌基因組DNA濃度分別為2.15×106～2.15 fg/μL；8：陰性對(duì)照。

2.2.2 純培養(yǎng)物靈敏度實(shí)驗(yàn) 對(duì)培養(yǎng)好的阪崎克羅諾桿菌菌液進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù),阪崎克羅諾桿菌液濃度為9.4×108CFU/mL。如圖3所示,阪崎克羅諾桿菌菌液稀釋到9.4×103CFU/mL時(shí),PCR檢測(cè)結(jié)果仍有肉眼可見(jiàn)條帶,可視為阪崎克羅諾桿菌純培養(yǎng)物檢測(cè)限為9.4×103CFU/mL。

圖3 阪崎克羅諾桿菌純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度Fig.3 Agarose gel electrophoresis showing sensitivity of detection of the PCR amplified Cronobacter sakazakii pure cultures注：M：D2000 DNA ladder marker；1～8：阪崎克羅諾桿菌濃度分別為9.4×106～9.4 CFU/mL；8：陰性對(duì)照。

2.3 人工污染食品樣品實(shí)驗(yàn)

嬰幼兒奶粉樣品中接種的阪崎克羅諾桿菌的三個(gè)濃度分別為94、9.4、0.94 CFU/g。PCR檢測(cè)結(jié)果如表2所示,接菌量為94 CFU/g的奶粉樣品,在增菌培養(yǎng)4 h后即可檢出,接菌量為9.4 CFU/g的奶粉樣品,在增菌培養(yǎng)6 h后可以檢出,接種量為0.94 CFU/g的奶粉樣品需要增菌8 h才可以檢出。這表明,該P(yáng)CR檢測(cè)方法最多經(jīng)8 h增菌培養(yǎng)后,即可從染菌量為0.94 CFU/g的奶粉樣品中檢出阪崎克羅諾桿菌。

表2 人工污染食品樣品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Detection for Cronobacter sakazakiiin artificially contaminated food samples

2.4 食品樣品檢測(cè)結(jié)果

從錦州菜市場(chǎng)隨機(jī)取51份食品檢測(cè)結(jié)果如表3所示,總計(jì)51份樣品中19份擴(kuò)增出目的條帶和擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)條帶,其中5份是未添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR檢測(cè)方法中產(chǎn)生的假陰性,經(jīng)本方法檢測(cè)出,表明食品樣品受阪崎克羅諾桿菌污染;32份樣品中只擴(kuò)增出擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)條帶,無(wú)目的條帶,表明食品未受阪崎克羅諾桿菌污染。

表3 食品樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Detection of food samples

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以細(xì)菌16S rRNA為擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)對(duì)照,以阪崎克羅諾桿菌的谷氧還蛋白2基因grxB為靶基因設(shè)計(jì)的引物具有良好的的特異性,引物grxBF/grxBR與引物27F/1492R之間沒(méi)有交叉反應(yīng)。

本研究建立的含擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的PCR檢測(cè)方法對(duì)阪崎克羅諾桿菌基因組純基因組DNA檢測(cè)靈敏度為2.15×102fg/μL,純培養(yǎng)物檢測(cè)靈敏度為9.4×103CFU/mL,與Dong[16]和Wang[18]建立的阪崎克羅諾桿菌檢測(cè)方法靈敏度103CFU/mL處于同一檢測(cè)水平。

人工污染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,阪崎克羅諾桿菌染菌量為0.94 CFU/g的奶粉樣品,經(jīng)過(guò)8 h增菌培養(yǎng)后,可被本研究檢測(cè)方法檢出。污染阪崎克羅諾桿菌的食品樣品最多經(jīng)過(guò)8 h增菌培養(yǎng)后即可被檢出,整個(gè)檢驗(yàn)流程可在12 h內(nèi)完成,檢測(cè)周期短,適用于阪崎克羅諾桿菌的快速檢測(cè)鑒定。食品樣品檢測(cè)結(jié)果表明,添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)方法能夠檢測(cè)出樣品中的阪崎克羅諾桿菌,并能夠避免假陰性對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成的影響。

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Establishment of a PCR method with an internal amplication control for detection ofCronobactersakazakiiin foods

ZHANG De-fu1,2,ZHAO Yu-zong1,ZHANG Ming1,YI Shu-min1,ZHAO Wen-zhu1,TANG Yi-wei1,LI Chun3,LI Jian-rong1,*

(1.College of Food Science and Project Engineering,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.Institute of Microbiology and Epidemiology,Academy of Military Medical Sciences,State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity,Beijing 100071,China;3.College of Mathematics and Physics,Bohai University,Jinzhou 121013,China)

The traditional detection method ofCronobactersakazakiiwas time-consuming,operation-complicated,low sensitivity and was often influenced by the environmental factors,and the physical and chemical properties of food,which might lead to false negative results. In this study,we used 16S rRNA gene as an internal amplification control,designed primers targetinggrxB ofC.sakazakii,optimized the reaction conditions and finally,established a PCR method with an internal amplication control forC.sakazakiidetection. The results of detection of 20 strains includingCronobacterand non-Cronobacterby this method showed that these primers were specific forC.sakazakiidetection. The sensitivity of established detection assay forC.sakazakiipurified genomic DNA and pure cultures were 2.15×102fg/μL and 9.4×103CFU/mL,respectively. The detection for artificially contaminated infant milk powder showed thatC.sakazakiicould be detected after 8 h enrichment culture when theC.sakazakiiinoculation was 0.94 CFU/g. This detection method demonstrated a good specificity and sensitivity,and could eliminate false-negative results caused by inhibitor of DNA polymerase in the PCR reaction reagents,and suitable for rapid detection of foodborneC.sakazakii.

Cronobactersakazakii;internal amplification control;false-negative;PCR detection

2016-06-28

張德福(1983-)，男，博士，講師，研究方向：食品安全與質(zhì)量控制，E-mail：zhangdf@bhu.edu.cn。

*通訊作者:勵(lì)建榮(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水產(chǎn)品和果蔬貯藏加工，食品安全，E-mail：lijr6491@163.com。

遼寧省教育廳項(xiàng)目(LY2016001)；遼寧省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(LNSAKF2013018)；遼寧省高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(LT2014024)。

TS201.6

A

1002-0306(2017)02-0049-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.001