檀 星，秦振華，田藝閣，李建芬，丁捷楓

(1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023； 2.武漢輕工大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430023)

竹干黃酮的抑菌性能研究

檀 星1，秦振華2*，田藝閣2，李建芬2，丁捷楓2

(1.武漢輕工大學生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023； 2.武漢輕工大學化學與環(huán)境工程學院，湖北 武漢 430023)

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、根霉和毛霉作為供試菌種，通過平板計數(shù)法和抑菌圈法研究竹干黃酮的抑菌性能，同時考察了竹干黃酮濃度、pH值、熱處理對竹干黃酮抑菌性能的影響。結(jié)果表明，竹干黃酮對細菌及霉菌均具有一定的抑制作用，并且對細菌的抑制作用強于霉菌；在酸性條件下，竹干黃酮的抑菌效果更好；竹干黃酮的熱穩(wěn)定性良好，100 ℃的熱處理對其抑菌性能沒有明顯影響。

油竹；竹干黃酮；抑菌性能；最低抑菌濃度

目前使用的三大類主要防腐劑為苯甲酸、山梨酸及其鹽類、對羥基苯甲酸酯，由于它們對食品的口感及人們的身體健康有不良影響，必須嚴格限制其在食品中的用量[1-2]。隨著科技的不斷發(fā)展，利用植物[3-6]、動物[7]或微生物[8]的代謝產(chǎn)物為原料，經(jīng)提取、酶法轉(zhuǎn)化或發(fā)酵等技術(shù)生產(chǎn)的天然抑菌劑和抗氧化劑逐漸受到人們的重視[9-10]。

竹子是我國重要的生態(tài)、產(chǎn)業(yè)和文化資源，我國現(xiàn)有竹類植物48個屬500余種，竹類植物面積、蓄積量及年產(chǎn)竹材量均占世界1/3 左右。竹干組織里含有豐富的生物活性物質(zhì)[11-14]，《名醫(yī)別錄》中記載竹瀝具有“治暴中風風痹，胸中大熱。止煩悶，消渴，勞復”的功效。隨著植物化學研究的發(fā)展和現(xiàn)代分析手段的進步，越來越多的竹子活性成分被發(fā)現(xiàn)并被應用，如醇、醛、酚酸、黃酮、香豆素、氨基酸、多糖、礦質(zhì)元素、天然色素、蛋白質(zhì)、茶多酚等。其中，黃酮糖苷和香豆素類內(nèi)酯具有優(yōu)良的抗自由基、抗氧化、抗衰老、降血脂、免疫調(diào)節(jié)及抗菌防腐等生物學功效[15-19]。

作者在此以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、根霉和毛霉作為供試菌種，通過平板計數(shù)法和抑菌圈法研究竹干黃酮的抑菌性能，同時考察竹干黃酮濃度、pH值、熱處理對竹干黃酮抑菌性能的影響，以期為竹資源的精深加工提供科學依據(jù)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

竹干黃酮：將采集于湖北省恩施州的油竹竹干洗凈，于40 ℃恒溫干燥箱中烘干粉碎，用70%乙醇溶液熱回流提取，將粗提物通過AB-8吸附樹脂純化后即得。

供試菌種：大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、根霉和毛霉。細菌培養(yǎng)在LB固體培養(yǎng)基上，霉菌培養(yǎng)在PDA固體培養(yǎng)基上，均保存在4 ℃冰箱中。

蛋白胨、瓊脂粉、葡萄糖、氯化鈉，國藥集團化學試劑有限公司；酵母提取物，揚州滬寶化學試劑有限公司；馬鈴薯，市售。

YXQ-LS-18SI型高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅；BBS-DDC-A型超凈工作臺，濟南巴艾貝斯；KY3662型水浴恒溫振蕩器，北京凱云儀科技有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海華鄰。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

LB固體培養(yǎng)基：取蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂10～20 g，加入1 000 mL蒸餾水，完全溶解，均分成10份置于錐形瓶中，密封，于高溫滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，備用。

LB液體培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

PDA固體培養(yǎng)基：取切塊馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g，加入1 000 mL蒸餾水，完全溶解，均分成10份置于錐形瓶中，密封，于高溫滅菌鍋中121 ℃滅菌25 min，備用。

PDA液體培養(yǎng)基：PDA固體培養(yǎng)基中不加瓊脂。

1.2.2 菌種活化及梯度菌懸液的制備

菌種活化：在超凈臺內(nèi)，用接種環(huán)分別從5個斜面培養(yǎng)基中挑選菌落接種到相應的液體培養(yǎng)基中。細菌在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；霉菌在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

梯度菌懸液的制備：取活化好的菌種置于無菌水小瓶中，搖勻，制成菌懸液；置于水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)；再用移液管取0.1 mL菌懸液于小離心管中，加入無菌水稀釋到1 mL，置于水浴恒溫振蕩器中培養(yǎng)，繼續(xù)從中移取0.1 mL稀釋。按此方法，每稀釋1次，濃度降低10倍；在相應固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，平板計數(shù)，確定最佳梯度濃度。

1.2.3 竹干黃酮抑菌性能的評價方法

分別采用平板計數(shù)法和抑菌圈法評價竹干黃酮對細菌和霉菌的抑菌性能。

平板計數(shù)法是將LB固體培養(yǎng)基加熱熔化裝入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固；用無菌移液管移取1.2.2中確定的最佳梯度濃度的細菌菌懸液0.1 mL與0.1 mL的竹干黃酮溶液混勻；均勻涂布在平板上，以無菌水作為空白對照，培養(yǎng)24 h后對菌落計數(shù)，計算抑菌率。

抑菌圈法是將PDA固體培養(yǎng)基加熱熔化裝入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固；用無菌移液管移取最佳梯度濃度的霉菌菌懸液0.1 mL涂布在平板上，用已滅菌的打孔器直接在培養(yǎng)皿上打出直徑6.0 mm的圓孔，每個平板打3個孔；吸取0.1 mL的竹干黃酮溶液置于圓孔內(nèi)，培養(yǎng)48 h后測量抑菌圈直徑。

1.2.4 抑菌性能影響因素考察

1.2.4.1 竹干黃酮濃度對抑菌效果的影響

用無菌水分別配制濃度為 0.1 mg·mL-1、0.6 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1的竹干黃酮溶液，以無菌水作為空白對照，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、根霉、毛霉為供試菌種，分別用平板計數(shù)法和抑菌圈法測定竹干黃酮濃度對抑菌效果的影響。

1.2.4.2 pH值對抑菌效果的影響

取1.0 mg·mL-1竹干黃酮溶液，以一定濃度的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液、碳酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，以相應pH值的無菌水溶液為空白對照，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、根霉、毛霉為供試菌種，分別用平板計數(shù)法和抑菌圈法測定pH值對抑菌效果的影響。

1.2.4.3 熱處理對抑菌效果的影響

將1.0 mg·mL-1的竹干黃酮溶液分成4份，分別于30 ℃、70 ℃、100 ℃、120 ℃加熱15 min，分別用平板計數(shù)法和抑菌圈法測定熱處理對抑菌效果的影響。

1.2.5 最低抑菌濃度(MIC)的測定

取最佳梯度濃度的菌懸液0.1 mL涂布在相應培養(yǎng)平板上；稀釋竹干黃酮溶液，依次得到濃度(mg·mL-1)為1.20、0.60、0.30、0.15、0.06、0.04、0.02的竹干黃酮稀釋液；分別取各濃度稀釋液0.1 mL涂布平板，以無菌水為空白對照，細菌在37 ℃培養(yǎng)1 d，霉菌在30 ℃培養(yǎng)2 d，以有菌落生長的最低竹干黃酮濃度作為MIC。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌懸液最佳梯度濃度

按1.2.2方法確定每一個菌種的最佳梯度濃度，菌落數(shù)在30～300的平板可以作為測定的標準，以2個平行樣中菌落數(shù)的平均值為菌落總數(shù)，結(jié)果如表1所示。

2.2 竹干黃酮抑菌性能評價

表1 菌懸液最佳梯度濃度及菌落數(shù)

Tab.1The optimum gradient concentration of bacterial suspension and corresponding colony forming unit

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h后取出，通過平板計數(shù)法研究竹干黃酮對細菌的抑菌性能；將根霉、毛霉在30 ℃下培養(yǎng)48 h后取出，通過抑菌圈法研究竹干黃酮對霉菌的抑菌性能，結(jié)果如圖1所示。

a.大腸桿菌 b.金黃色葡萄球菌 c.芽孢桿菌 d.根霉 e.毛霉 A，B.添加竹干黃酮 C.未添加竹干黃酮

由圖1a～c可知，加入竹干黃酮后，各細菌的菌落總數(shù)明顯減少；由圖1d～e可知，加入竹干黃酮后，孔徑周圍都有抑菌圈，但抑菌圈直徑都較小。表明，竹干黃酮對細菌的抑制作用較強，對霉菌的抑制作用一般。

2.3 竹干黃酮濃度對抑菌效果的影響

配制不同濃度的竹干黃酮溶液，考察其對供試菌種的抑菌效果，結(jié)果見表2。

從表2可知，當竹干黃酮濃度大于1.0 mg·mL-1時，其對細菌的抑制作用較強，但是對霉菌的抑制作用一般；隨著竹干黃酮濃度的減小，抑制作用均有一定程度的減弱，尤其是對根霉與毛霉的抑制作用下降顯著。這與余曉紅等[20]報道的蘆葦黃酮的抑菌效果一致。

表2竹干黃酮濃度對抑菌效果的影響

Tab.2 Influence of concentration of flavonoids from stemsof Bambusa surrecta on antibacterial effect

2.4 pH值對抑菌效果的影響

pH值既可影響微生物抑制劑的效價及其與微生物細胞表面位點的結(jié)合力，使微生物細胞壁或原生質(zhì)膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，影響生物膜的通透性，使抑菌劑更難或更易到達作用部位，也可影響微生物的存活率和生長速度，改變抑菌劑的存在狀態(tài)。pH值對竹干黃酮抑菌效果的影響見表3。

表3pH值對竹干黃酮抑菌效果的影響

Tab.3Influence of pH value of flavonoids from stems of Bambusa surrecta on antibacterial effect

從表3可知，在酸性條件下，竹干黃酮對細菌和霉菌的抑制作用較強；隨著pH值的增大，抑制作用有所減弱；當pH值為8.0時，竹干黃酮對各細菌的抑菌率均低于50%。這可能是因為，在堿性條件下，弱酸性的黃酮分子發(fā)生去質(zhì)子化，分子結(jié)構(gòu)的變化可能影響了竹干黃酮的抑菌性能。

2.5 熱處理對抑菌效果的影響(圖2)

從圖2可知，熱處理對竹干黃酮抑菌效果有一定影響，當熱處理溫度低于100 ℃時，抑菌效果無明顯差異；當熱處理溫度高于100 ℃后，抑菌效果開始有所減弱。表明，竹干黃酮在100 ℃內(nèi)熱穩(wěn)定性良好，這對一般食品加工應用具有重要意義。

2.6 竹干黃酮的最低抑菌濃度(表4)

從表4可知，竹干黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC為0.04 mg·mL-1，對芽孢桿菌的MIC為0.06 mg·mL-1，對毛霉和根霉的MIC為0.30 mg·mL-1。表明，竹干黃酮對霉菌的MIC要高于對細菌的MIC。

3 結(jié)論

竹干黃酮對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、根霉、毛霉均具有一定的抑制作用，且相同濃度下對細菌的抑制作用要優(yōu)于霉菌。pH值對竹干黃酮的抑菌效果影響較大，酸性條件下，竹干黃酮的抑菌效果較好；堿性條件下，其抑菌效果顯著減弱，說明竹干黃

圖2 熱處理對竹干黃酮抑菌效果的影響

表4竹干黃酮對細菌、霉菌的最低抑菌濃度

Tab.4 MIC of flavonoids from stems of Bambusa surrectaagainst bacteria and molds

注：“++”表示明顯抑菌效果；“+”表示有抑菌效果；“-”表示無抑菌效果。

酮適用于酸性和中性食品的防腐保鮮。竹干黃酮的熱穩(wěn)定性較好，在100 ℃內(nèi)處理15 min對其抑菌性能沒有明顯影響。表明，竹干黃酮可以作為一種能加熱處理的天然植物源防腐劑，具有較高的應用價值。

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Antibacterial Property of Flavonoids from Stems ofBambusasurrecta

TAN Xing1,QIN Zhen-hua2*,TIAN Yi-ge2,LI Jian-fen2,DING Jie-feng2

(1.SchoolofBiologyandPharmaceuticalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China; 2.SchoolofChemistryandEnvironmentalEngineering,WuhanPolytechnicUniversity,Wuhan430023,China)

UsingEscherichia coli,Staphylococcus aureus,Bacillus subtilis,RhizopusandMucorasteststrains,theantibacterialpropertyofflavonoidsfromstemsofBambusa surrectawasstudiedbyplatecountmethodandinhibitionzonemethod.TheeffectsofconcentrationofflavonoidsfromstemsofBambusa surrecta,pHvalueandheattreatmentontheantibacterialpropertyofflavonoidswereinvestigated.Theresultsshowedthat,flavonoidsfromstemsofBambusa surrectahadfavourableinhibitoryeffectonbacteriaandmolds,andtheinhibitoryeffectonbacteriawasbetterthanmolds.FlavonoidsfromstemsofBambusa surrectashowedgoodinhibitoryeffectundertheacidiccondition,thethermalstabilityofflavonoidsfromstemsofBambusa surrectawasalsogood,andtheheattreatmentat100 ℃hadnoobviouseffectonitsantibacterialproperty.

Bambusa surrecta;flavonoidsfromstemsofBambusa surrecta;antibacterialproperty;minimalinhibitoryconcentration

湖北省高校優(yōu)秀中青年科技創(chuàng)新團隊計劃資助項目(T201407)，公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503315)

2016-10-14

檀星(1989-)，男，湖北武漢人，碩士研究生，研究方向：植物資源的開發(fā)和應用評價，E-mail:whpuchem@126.com；通訊作者：秦振華，講師，E-mail:18171177185@126.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.02.009

R 285.5

A

1672-5425(2017)02-0038-04

檀星，秦振華，田藝閣，等.竹干黃酮的抑菌性能研究[J].化學與生物工程，2017，34(2)：38-41，53.