祁存芳，閆 帥，何 敏，劉 芳，唐延軍，黃明玉

(1.青海大學醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，基礎醫(yī)學實驗中心，青海 西寧 810001；2.解放軍第四醫(yī)院內科，青海 西寧 810007)

大量實驗研究發(fā)現，成體哺乳動物腦內存在神經干細胞(neural stem and cells，NSCs)巢，NSCs在嗅球、皮層、室管膜區(qū)或室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)、紋狀體(striatum)、齒狀回(dentate gyrus，DG)顆粒細胞下區(qū)(Subgranular zone，SGZ)等組織中存在，NSCs具有自我增殖和潛在分化的能力。正常生理情況下，SVZ和SGZ僅有少量神經發(fā)生，以補償生理的損失量。但在某些病理條件如腦缺血的情況下，SVZ和SGZ的NSCs被激活，促進其自我增殖，并分化為神經元整合到神經元網絡，發(fā)揮自我修復作用。高海拔環(huán)境是一個相對缺氧的環(huán)境，目前對急性高原缺氧導致的海馬顆粒細胞變性壞死或凋亡的研究有許多報道，但急性高原缺氧刺激對海馬齒狀回NSCs影響的研究報道很少，且結論不一。本研究采用低壓氧艙模擬海拔5 000米高原環(huán)境，觀察大鼠初次從海拔400米急進5 000米環(huán)境持續(xù)滯留3天，返回到海拔2 200米環(huán)境后，觀察急性低壓缺氧刺激對大鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經干細胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SD雄性大鼠120只，體重約280～310 g，由西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心提供，清潔級，動物合格證號No. 22-9601018。

1.1.2 試劑

5-溴脫氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)購于Sigma公司，抗BrdU小鼠單克隆抗體購于CST公司，抗雙皮質素(Doublecortin，DCX)兔單克隆抗體購于Abcam公司，抗膠質纖維酸性蛋白(Glial FibrillaryAcidic Protein，GFAP)兔多克隆抗體購于Thermo公司，SABC試劑盒購于武漢博士德公司，生物素標記羊抗鼠/兔IG、FITC/Cy3標記熒光二抗購于北京康為公司。

1.2 方法

1.2.1 高原缺氧損傷模型的建立和組織取材

動物隨機分組：高海拔預處理組經模擬5 000米海拔低壓氧艙預處理3天，轉移至海拔2 200米環(huán)境行常規(guī)飼養(yǎng)；對照組在海拔2 200米環(huán)境行常規(guī)飼養(yǎng)，分別在常規(guī)飼養(yǎng)1、3、7、14、28天后行組織取材。

1.2.2 BrdU標記

將10 mg/mL濃度的BrdU溶于0.9%氯化鈉溶液中，配置成1%的溶液，行BrdU腹腔注射(50mg/kg每天注射3次，連續(xù)注射3天)。

1.2.3 BrdU免疫組織化學染色

1.2.4 BrdU/DCX、BrdU/GFAP免疫熒光雙標染色

組織切片脫蠟、水化，抗原熱修復和BrdU變性、封閉等步驟同免疫組化染色步驟。

1.2.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 BrdU陽性細胞分布和計數

BrdU陽性細胞細胞核呈深染的棕色或黃色顆粒狀，低壓缺氧損傷后，在海馬齒狀回的門區(qū)和周圍出現較多的BrdU免疫陽性反應細胞(圖1A，C)。海馬齒狀回顆粒細胞下層有典型的BrdU免疫陽性細胞表達(圖1B，D)。BrdU陽性細胞計數結果顯示：低壓缺氧激活SGZ的NSCs增殖，低壓缺氧損傷后第3天和7天，實驗組陽性細胞計數顯著高于對照組(P<0.001)；低壓缺氧損傷后第14天，實驗組陽性細胞計數明顯高于對照組(P<0.01)(表1 )。

A：對照組海馬齒狀回BrdU陽性細胞分布；B：圖A中框選區(qū)放大圖像，箭頭指示SGZ的BrdU陽性細胞；C：實驗組海馬齒狀回BrdU陽性細胞分布；D：圖C中框選區(qū)放大圖像，箭頭指示SGZ的BrdU陽性細胞

圖1低壓缺氧刺激后大鼠齒狀回BrdU陽性細胞表達圖

Figure1ExpressionofBrdUpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表1低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回BrdU陽性細胞計數表

Table 1 The number of BrdU positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

2.2 BrdU/DCX免疫熒光染色和陽性細胞計數

為了觀察低壓缺氧對增殖NSCs向神經元方向分化的影響，采用免疫熒光雙標染色法檢測未成熟神經元標記蛋白DCX和BrdU的共表達。結果顯示，DCX免疫陽性細胞主要分布于顆粒細胞下層，海馬齒狀回的門區(qū)有少量DCX陽性細胞(圖2 A-H)，在低壓缺氧損傷后第14天和28 天，顆粒細胞層有少量DCX陽性細胞表達(圖2 I，J)，陽性細胞計數結果顯示，低壓缺氧促進SGZ未成熟神經元增殖，低壓缺氧損傷后第1天和7天實驗組SGZ DCX免疫陽性細胞數高于對照組(P<0.05)；低壓缺氧損傷后第3天實驗組SGZ DCX免疫陽性細胞數顯著高于對照組(P<0.001)(表2)。統(tǒng)計BrdU/DCX雙標陽性細胞占所有BrdU陽性細胞的比例，實驗組雙標陽性比例介于85.4%～89.2%，對照組雙標陽性比例介于82.6%～88.3%，統(tǒng)計學分析顯示各時間點實驗組和對照組比較沒有顯著性差異(表3)。

A：對照組海馬齒狀回DCX陽性細胞主要分布于顆粒細胞下層；B：對照組海馬齒狀回BrdU陽性細胞分布于顆粒細胞下層；C：對照組BrdU和DCX在海馬齒狀回共表達；D：框選C圖的放大圖像，箭頭指示雙標陽性細胞；E：實驗組海馬齒狀回DCX陽性細胞主要分布于顆粒細胞下層；F：實驗組海馬齒狀回BrdU陽性細胞分布于顆粒細胞下層；G：實驗組BrdU和DCX在海馬齒狀回共表達；H：框選G圖的放大圖像，箭頭指示雙標陽性細胞； I：低壓缺氧損傷后第14 d，箭頭指示海馬齒狀回顆粒細胞層有BrdU和DCX雙標陽性細胞；J：低壓缺氧損傷后第28 d，箭頭指示海馬齒狀回顆粒細胞層BrdU和DCX雙標陽性細胞

圖2低壓缺氧刺激后大鼠海馬齒狀回DCX陽性細胞表達和分布圖

Figure2ExpressionanddistributionofDCXpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表2低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回DCX陽性細胞計數表

Table 2 The number of DCX positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

表3低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回BrdU/DCX雙標陽性細胞比例表

Table 3 The ratio of BrdU/DCX double positive cells in the hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

2.3 BrdU/GFAP免疫熒光雙標染色和陽性細胞計數

為了觀察低壓缺氧刺激對增殖NSCs向膠質細胞方向分化的影響，采用免疫熒光雙標染色法檢測星形膠質細胞標記蛋白GFAP和BrdU的共表達。結果顯示，GFAP免疫陽性細胞分布廣泛，在海馬齒狀回顆粒細胞周圍有大量GFAP免疫陽性表達，在顆粒細胞下層有少量GFAP免疫陽性表達(圖3 A-H)。陽性細胞計數結果顯示，低壓缺氧促進膠質細胞增殖，低壓缺氧損傷后第1天和3天實驗組齒狀回GFAP免疫陽性細胞明顯多于對照組(P<0.001)(表4)。統(tǒng)計BrdU/GFAP雙標陽性細胞占所有BrdU陽性細胞的比例，結果顯示低壓缺氧損傷后第1天和7天實驗組雙標陽性率高于對照組(P<0.05)，低壓缺氧損傷后第3天實驗組雙標陽性率明顯高于對照組(P<0.01)(表5)。

A：對照組海馬齒狀回GFAP細胞廣泛分布于海馬齒狀回周圍組織；B：對照組BrdU陽性細胞分布于海馬齒狀回顆粒細胞下層和周圍組織；C：對照組BrdU和GFAP在海馬齒狀回共表達；D：框選C圖的放大圖像，箭頭指示雙標陽性細胞；E：實驗組海馬齒狀回GFAP陽性細胞表達和分布；F：實驗組海馬齒狀回BrdU陽性細胞表達和分布；G：實驗組BrdU和GFAP在海馬齒狀回共表達；H：框選G圖的放大圖像，箭頭指示雙標陽性細胞

圖3低壓缺氧刺激后大鼠海馬齒狀回GFAP陽性細胞表達和分布圖

Figure3ExpressionanddistributionofGFAPpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表4低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回GFAP陽性細胞計數表

Table 4 The number of GFAP positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

表5低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回BrdU/GFAP雙標陽性細胞比例表

Table 5 The ratio of BrdU/GFAP double positive cells in the hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

3 討論

高海拔地區(qū)空氣稀薄，大氣壓和空氣中氧氣分壓明顯低于低海拔地區(qū)，海拔5 000米時大氣壓強為53.732 Kpa，約為海平面的55%左右，而空氣含氧量比零海拔下降8%，約為12.95%，是零海拔含氧量的61.8%。當我們初次進入高海拔地區(qū)后，機體各系統(tǒng)器官結構對高海拔低壓缺氧刺激產生不同的反應表現，其中中樞神經系統(tǒng)對高海拔低壓缺氧反應敏感，輕度缺氧時，整個神經系統(tǒng)興奮性增強，生理表現為緊張、激動、頭痛、失眠、健忘等，海拔繼續(xù)升高時神經系統(tǒng)則由興奮轉入抑制，出現神志不清、反應遲鈍、食欲不振等不良反應。海馬組織結構及齒狀回的神經元活性和纖維聯系在學習記憶功能正常發(fā)揮中有重要作用，而海馬組織細胞對缺氧極度敏感，研究顯示，低壓缺氧嚴重影響腦組織結構和功能，特別是神經認知功能和空間記憶能力[1]。嚴重缺氧導致海馬細胞變性、壞死，并促進海馬細胞凋亡，對學習記憶功能造成損傷，而這種損傷在以往的經驗中認為是不可逆不能修復的。但隨著近十多年來對成體腦內NSCs研究的不斷深入發(fā)現，成年哺乳動物的中樞神經系統(tǒng)中存在著具有增殖和分化潛能的多能干細胞，它們具有多向分化、高度增殖的能力，經過對稱分裂和不對稱分裂可以產生新的NSCs和神經前體細胞，而所產生的神經前體細胞進而可以分化成具有特定功能類型的神經元和神經膠質細胞，可維持局部神經網絡的完整和更新[2，3]。研究發(fā)現海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)是NSCs富集區(qū)，生理條件下就有少量干細胞增殖、遷移，分化為功能細胞，用以補充生理丟失量[4，5]。而且在多種病理情況下，如腦缺血[6，7]和阿爾茨海默病[8，9]、抑郁癥[10，11]、精神分裂癥[12]等，海馬齒狀回SGZ的NSCs進入到神經發(fā)生進程，通過干細胞增殖、遷移和定向分化，可以補充損失的神經細胞，進而改善和修復損傷的神經功能。

神經發(fā)生是細胞本身內部基因的調控和細胞外各種刺激因素相互作用與調節(jié)的結果。影響海馬神經發(fā)生過程受各種因素的調節(jié)，包括神經營養(yǎng)因子、炎癥因子、細胞周期調控因子和神經遞質及激素等，這些調節(jié)因素通過多種信號通路發(fā)揮作用。低壓缺氧刺激誘導機體出現應激反應，近年來研究發(fā)現，應激反應是神經發(fā)生最重要的調節(jié)因素[13]。我們采用BrdU標記技術，觀察在模擬海拔5 000米環(huán)境下，急性低壓缺氧刺激對SGZ NSCs神經發(fā)生的影響。BrdU是一種嘧啶類似物，在細胞周期S期DNA的合成中可以摻入到DNA鏈中。并隨著DNA的復制延續(xù)到新的增殖細胞中，因此常作為增殖細胞的標記物。實驗結果顯示，急性低壓缺氧損傷后，SGZ出現NSCs的增殖，增殖細胞數明顯高于對照組，雖然增殖細胞的總體數量較少，但增殖周期一致持續(xù)到損傷后14天。進一步我們采用免疫熒光雙標染色技術，觀察DCX/BrdU和GFAP/BrdU雙標染色情況，分析增殖細胞的分化能力和分化方向，其中DCX是未成熟神經元的標記物，GFAP是星形膠質細胞標記物。結果顯示，低壓缺氧刺激促進SGZ的DCX陽性細胞表達，在SGZ，BrdU/DCX雙標陽性細胞占所有BrdU陽性細胞的比例接近90%，而且在顆粒細胞層也發(fā)現少量雙標陽性細胞。結果提示，新增殖的細胞大部分向神經元方向分化，并可以向顆粒細胞層遷移。在低壓缺氧損傷后1～3天，BrdU陽性細胞除了在SGZ表達，在海馬的其他區(qū)域也大量出現，而GFAP也在低壓缺氧損傷后1～3天在海馬顆粒細胞周圍大量表達，BrdU/GFAP雙標陽性細胞雖然在SGZ很少見，但在海馬神經元周圍有較多的雙標陽性細胞，而且這些雙標陽性細胞高表達持續(xù)時間比較短暫。分析結果，在海馬齒狀回周圍大量的BrdU/GFAP雙標陽性細胞應該是反應性增殖的星形膠質細胞，而在SGZ，BrdU/GFAP 雙標細胞數量很少。結果提示，增殖干細胞向膠質細胞方向分化比例低。

高原低壓缺氧應激刺激調節(jié)神經發(fā)生的機制涉及多個方面，首先，缺氧應激激活腎上腺糖皮質激素信號途徑，產生的糖皮質激素穿過血腦屏障與大腦許多區(qū)域的糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體結合發(fā)揮負反饋性調節(jié)作用。研究發(fā)現，在海馬齒狀回有廣發(fā)分布的糖皮質激素受體和鹽皮質激素受體，但在在體和體外實驗發(fā)現，海馬部分前體細胞中只有糖皮質激素受體而沒有鹽皮質激素受體[14]，而實驗性敲除小鼠SGZ 區(qū)的糖皮質激素受體，SGZ 區(qū)神經細胞增殖和分化增多[15]。糖皮質激素和受體結合后調節(jié)下游的相關基因，通過基因轉錄分析表明大量的信號通路受到影響，其中包括與成體神經發(fā)生密切相關的信號通路，譬如Hedgehog 信號通路和TGF-β信號通路[16，17]等。其次，缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor1，HIF-1)是一種缺氧應激性產物，在缺氧刺激后，穩(wěn)定表達的HIF-1激活其下游基因的表達[18]，其中包括VEGF、EPO、iNOS等超過100個下游基因的表達[19，20]。有這些基因編碼的蛋白參與多種病理生理過程：包括葡萄糖轉運及酵解；紅細胞生成；氧化應激反應；促炎或抗炎反應；血管新生與重塑，以及中樞和周圍神經再生等。實驗發(fā)現，在相對缺氧環(huán)境下，在SVZ、SGZ，BrdU陽性細胞數都明顯高于常氧環(huán)境；敲除HIF-1α 基因的大鼠生理狀態(tài)下NSCs數量可減少近50%[21]，結果提示干細胞增殖和HIF-1α的表達相關。缺氧應激還可以通過調節(jié)Shh蛋白和Wnt蛋白等決定細胞分化和調節(jié)成體神經發(fā)生的形態(tài)發(fā)生因子，可以激活SHH和Wnt信號通路，進而調節(jié)成體神經發(fā)生。此外，缺氧刺激影響炎性分子等細胞因子和BDNF等神經營養(yǎng)因子的分泌，進而通過相應的信號分子調節(jié)成體神經發(fā)生。

總之，急性低壓缺氧刺激可能通過多種途徑激活海馬齒狀回顆粒細胞下區(qū)NSCs的增殖，并促進新生前體細胞向神經元方向分化，雖然存在增殖細胞數量較低，并且能夠存活下來整合到損傷神經網絡的細胞也較少，但其潛在的內源性修復作用對缺氧應激性腦損傷有一定的替代治療和腦保護作用。在今后的研究中，進一步深入探索急慢性低壓缺氧刺激后神經發(fā)生的調節(jié)機制，可為此類疾病的治療和藥物開發(fā)提供作用靶點。

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