祁存芳，閆 帥，何 敏，劉 芳，唐延軍，黃明玉

(1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗中心，青海 西寧 810001；2.解放軍第四醫(yī)院內(nèi)科，青海 西寧 810007)

大量實驗研究發(fā)現(xiàn)，成體哺乳動物腦內(nèi)存在神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem and cells，NSCs)巢，NSCs在嗅球、皮層、室管膜區(qū)或室管膜下區(qū)(subventricular zone，SVZ)、紋狀體(striatum)、齒狀回(dentate gyrus，DG)顆粒細(xì)胞下區(qū)(Subgranular zone，SGZ)等組織中存在，NSCs具有自我增殖和潛在分化的能力。正常生理情況下，SVZ和SGZ僅有少量神經(jīng)發(fā)生，以補償生理的損失量。但在某些病理條件如腦缺血的情況下，SVZ和SGZ的NSCs被激活，促進(jìn)其自我增殖，并分化為神經(jīng)元整合到神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮自我修復(fù)作用。高海拔環(huán)境是一個相對缺氧的環(huán)境，目前對急性高原缺氧導(dǎo)致的海馬顆粒細(xì)胞變性壞死或凋亡的研究有許多報道，但急性高原缺氧刺激對海馬齒狀回NSCs影響的研究報道很少，且結(jié)論不一。本研究采用低壓氧艙模擬海拔5 000米高原環(huán)境，觀察大鼠初次從海拔400米急進(jìn)5 000米環(huán)境持續(xù)滯留3天，返回到海拔2 200米環(huán)境后，觀察急性低壓缺氧刺激對大鼠海馬齒狀回顆粒下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

SD雄性大鼠120只，體重約280～310 g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，清潔級，動物合格證號No. 22-9601018。

1.1.2 試劑

5-溴脫氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)購于Sigma公司，抗BrdU小鼠單克隆抗體購于CST公司，抗雙皮質(zhì)素(Doublecortin，DCX)兔單克隆抗體購于Abcam公司，抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial FibrillaryAcidic Protein，GFAP)兔多克隆抗體購于Thermo公司，SABC試劑盒購于武漢博士德公司，生物素標(biāo)記羊抗鼠/兔IG、FITC/Cy3標(biāo)記熒光二抗購于北京康為公司。

1.2 方法

1.2.1 高原缺氧損傷模型的建立和組織取材

動物隨機(jī)分組：高海拔預(yù)處理組經(jīng)模擬5 000米海拔低壓氧艙預(yù)處理3天，轉(zhuǎn)移至海拔2 200米環(huán)境行常規(guī)飼養(yǎng)；對照組在海拔2 200米環(huán)境行常規(guī)飼養(yǎng)，分別在常規(guī)飼養(yǎng)1、3、7、14、28天后行組織取材。

1.2.2 BrdU標(biāo)記

將10 mg/mL濃度的BrdU溶于0.9%氯化鈉溶液中，配置成1%的溶液，行BrdU腹腔注射(50mg/kg每天注射3次，連續(xù)注射3天)。

1.2.3 BrdU免疫組織化學(xué)染色

1.2.4 BrdU/DCX、BrdU/GFAP免疫熒光雙標(biāo)染色

組織切片脫蠟、水化，抗原熱修復(fù)和BrdU變性、封閉等步驟同免疫組化染色步驟。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 BrdU陽性細(xì)胞分布和計數(shù)

BrdU陽性細(xì)胞細(xì)胞核呈深染的棕色或黃色顆粒狀，低壓缺氧損傷后，在海馬齒狀回的門區(qū)和周圍出現(xiàn)較多的BrdU免疫陽性反應(yīng)細(xì)胞(圖1A，C)。海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層有典型的BrdU免疫陽性細(xì)胞表達(dá)(圖1B，D)。BrdU陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示：低壓缺氧激活SGZ的NSCs增殖，低壓缺氧損傷后第3天和7天，實驗組陽性細(xì)胞計數(shù)顯著高于對照組(P<0.001)；低壓缺氧損傷后第14天，實驗組陽性細(xì)胞計數(shù)明顯高于對照組(P<0.01)(表1 )。

A：對照組海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞分布；B：圖A中框選區(qū)放大圖像，箭頭指示SGZ的BrdU陽性細(xì)胞；C：實驗組海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞分布；D：圖C中框選區(qū)放大圖像，箭頭指示SGZ的BrdU陽性細(xì)胞

圖1低壓缺氧刺激后大鼠齒狀回BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)圖

Figure1ExpressionofBrdUpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表1低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回BrdU陽性細(xì)胞計數(shù)表

Table 1 The number of BrdU positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

2.2 BrdU/DCX免疫熒光染色和陽性細(xì)胞計數(shù)

為了觀察低壓缺氧對增殖NSCs向神經(jīng)元方向分化的影響，采用免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測未成熟神經(jīng)元標(biāo)記蛋白DCX和BrdU的共表達(dá)。結(jié)果顯示，DCX免疫陽性細(xì)胞主要分布于顆粒細(xì)胞下層，海馬齒狀回的門區(qū)有少量DCX陽性細(xì)胞(圖2 A-H)，在低壓缺氧損傷后第14天和28 天，顆粒細(xì)胞層有少量DCX陽性細(xì)胞表達(dá)(圖2 I，J)，陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，低壓缺氧促進(jìn)SGZ未成熟神經(jīng)元增殖，低壓缺氧損傷后第1天和7天實驗組SGZ DCX免疫陽性細(xì)胞數(shù)高于對照組(P<0.05)；低壓缺氧損傷后第3天實驗組SGZ DCX免疫陽性細(xì)胞數(shù)顯著高于對照組(P<0.001)(表2)。統(tǒng)計BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞占所有BrdU陽性細(xì)胞的比例，實驗組雙標(biāo)陽性比例介于85.4%～89.2%，對照組雙標(biāo)陽性比例介于82.6%～88.3%，統(tǒng)計學(xué)分析顯示各時間點實驗組和對照組比較沒有顯著性差異(表3)。

A：對照組海馬齒狀回DCX陽性細(xì)胞主要分布于顆粒細(xì)胞下層；B：對照組海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞分布于顆粒細(xì)胞下層；C：對照組BrdU和DCX在海馬齒狀回共表達(dá)；D：框選C圖的放大圖像，箭頭指示雙標(biāo)陽性細(xì)胞；E：實驗組海馬齒狀回DCX陽性細(xì)胞主要分布于顆粒細(xì)胞下層；F：實驗組海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞分布于顆粒細(xì)胞下層；G：實驗組BrdU和DCX在海馬齒狀回共表達(dá)；H：框選G圖的放大圖像，箭頭指示雙標(biāo)陽性細(xì)胞； I：低壓缺氧損傷后第14 d，箭頭指示海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層有BrdU和DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞；J：低壓缺氧損傷后第28 d，箭頭指示海馬齒狀回顆粒細(xì)胞層BrdU和DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞

圖2低壓缺氧刺激后大鼠海馬齒狀回DCX陽性細(xì)胞表達(dá)和分布圖

Figure2ExpressionanddistributionofDCXpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表2低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回DCX陽性細(xì)胞計數(shù)表

Table 2 The number of DCX positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

表3低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞比例表

Table 3 The ratio of BrdU/DCX double positive cells in the hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

2.3 BrdU/GFAP免疫熒光雙標(biāo)染色和陽性細(xì)胞計數(shù)

為了觀察低壓缺氧刺激對增殖NSCs向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化的影響，采用免疫熒光雙標(biāo)染色法檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記蛋白GFAP和BrdU的共表達(dá)。結(jié)果顯示，GFAP免疫陽性細(xì)胞分布廣泛，在海馬齒狀回顆粒細(xì)胞周圍有大量GFAP免疫陽性表達(dá)，在顆粒細(xì)胞下層有少量GFAP免疫陽性表達(dá)(圖3 A-H)。陽性細(xì)胞計數(shù)結(jié)果顯示，低壓缺氧促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增殖，低壓缺氧損傷后第1天和3天實驗組齒狀回GFAP免疫陽性細(xì)胞明顯多于對照組(P<0.001)(表4)。統(tǒng)計BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞占所有BrdU陽性細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示低壓缺氧損傷后第1天和7天實驗組雙標(biāo)陽性率高于對照組(P<0.05)，低壓缺氧損傷后第3天實驗組雙標(biāo)陽性率明顯高于對照組(P<0.01)(表5)。

A：對照組海馬齒狀回GFAP細(xì)胞廣泛分布于海馬齒狀回周圍組織；B：對照組BrdU陽性細(xì)胞分布于海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下層和周圍組織；C：對照組BrdU和GFAP在海馬齒狀回共表達(dá)；D：框選C圖的放大圖像，箭頭指示雙標(biāo)陽性細(xì)胞；E：實驗組海馬齒狀回GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)和分布；F：實驗組海馬齒狀回BrdU陽性細(xì)胞表達(dá)和分布；G：實驗組BrdU和GFAP在海馬齒狀回共表達(dá)；H：框選G圖的放大圖像，箭頭指示雙標(biāo)陽性細(xì)胞

圖3低壓缺氧刺激后大鼠海馬齒狀回GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)和分布圖

Figure3ExpressionanddistributionofGFAPpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表4低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回GFAP陽性細(xì)胞計數(shù)表

Table 4 The number of GFAP positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

表5低壓缺氧刺激后不同時間點大鼠齒狀回BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞比例表

Table 5 The ratio of BrdU/GFAP double positive cells in the hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

3 討論

高海拔地區(qū)空氣稀薄，大氣壓和空氣中氧氣分壓明顯低于低海拔地區(qū)，海拔5 000米時大氣壓強(qiáng)為53.732 Kpa，約為海平面的55%左右，而空氣含氧量比零海拔下降8%，約為12.95%，是零海拔含氧量的61.8%。當(dāng)我們初次進(jìn)入高海拔地區(qū)后，機(jī)體各系統(tǒng)器官結(jié)構(gòu)對高海拔低壓缺氧刺激產(chǎn)生不同的反應(yīng)表現(xiàn)，其中中樞神經(jīng)系統(tǒng)對高海拔低壓缺氧反應(yīng)敏感，輕度缺氧時，整個神經(jīng)系統(tǒng)興奮性增強(qiáng)，生理表現(xiàn)為緊張、激動、頭痛、失眠、健忘等，海拔繼續(xù)升高時神經(jīng)系統(tǒng)則由興奮轉(zhuǎn)入抑制，出現(xiàn)神志不清、反應(yīng)遲鈍、食欲不振等不良反應(yīng)。海馬組織結(jié)構(gòu)及齒狀回的神經(jīng)元活性和纖維聯(lián)系在學(xué)習(xí)記憶功能正常發(fā)揮中有重要作用，而海馬組織細(xì)胞對缺氧極度敏感，研究顯示，低壓缺氧嚴(yán)重影響腦組織結(jié)構(gòu)和功能，特別是神經(jīng)認(rèn)知功能和空間記憶能力[1]。嚴(yán)重缺氧導(dǎo)致海馬細(xì)胞變性、壞死，并促進(jìn)海馬細(xì)胞凋亡，對學(xué)習(xí)記憶功能造成損傷，而這種損傷在以往的經(jīng)驗中認(rèn)為是不可逆不能修復(fù)的。但隨著近十多年來對成體腦內(nèi)NSCs研究的不斷深入發(fā)現(xiàn)，成年哺乳動物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著具有增殖和分化潛能的多能干細(xì)胞，它們具有多向分化、高度增殖的能力，經(jīng)過對稱分裂和不對稱分裂可以產(chǎn)生新的NSCs和神經(jīng)前體細(xì)胞，而所產(chǎn)生的神經(jīng)前體細(xì)胞進(jìn)而可以分化成具有特定功能類型的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可維持局部神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的完整和更新[2，3]。研究發(fā)現(xiàn)海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)是NSCs富集區(qū)，生理條件下就有少量干細(xì)胞增殖、遷移，分化為功能細(xì)胞，用以補充生理丟失量[4，5]。而且在多種病理情況下，如腦缺血[6，7]和阿爾茨海默病[8，9]、抑郁癥[10，11]、精神分裂癥[12]等，海馬齒狀回SGZ的NSCs進(jìn)入到神經(jīng)發(fā)生進(jìn)程，通過干細(xì)胞增殖、遷移和定向分化，可以補充損失的神經(jīng)細(xì)胞，進(jìn)而改善和修復(fù)損傷的神經(jīng)功能。

神經(jīng)發(fā)生是細(xì)胞本身內(nèi)部基因的調(diào)控和細(xì)胞外各種刺激因素相互作用與調(diào)節(jié)的結(jié)果。影響海馬神經(jīng)發(fā)生過程受各種因素的調(diào)節(jié)，包括神經(jīng)營養(yǎng)因子、炎癥因子、細(xì)胞周期調(diào)控因子和神經(jīng)遞質(zhì)及激素等，這些調(diào)節(jié)因素通過多種信號通路發(fā)揮作用。低壓缺氧刺激誘導(dǎo)機(jī)體出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，近年來研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激反應(yīng)是神經(jīng)發(fā)生最重要的調(diào)節(jié)因素[13]。我們采用BrdU標(biāo)記技術(shù)，觀察在模擬海拔5 000米環(huán)境下，急性低壓缺氧刺激對SGZ NSCs神經(jīng)發(fā)生的影響。BrdU是一種嘧啶類似物，在細(xì)胞周期S期DNA的合成中可以摻入到DNA鏈中。并隨著DNA的復(fù)制延續(xù)到新的增殖細(xì)胞中，因此常作為增殖細(xì)胞的標(biāo)記物。實驗結(jié)果顯示，急性低壓缺氧損傷后，SGZ出現(xiàn)NSCs的增殖，增殖細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組，雖然增殖細(xì)胞的總體數(shù)量較少，但增殖周期一致持續(xù)到損傷后14天。進(jìn)一步我們采用免疫熒光雙標(biāo)染色技術(shù)，觀察DCX/BrdU和GFAP/BrdU雙標(biāo)染色情況，分析增殖細(xì)胞的分化能力和分化方向，其中DCX是未成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物，GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物。結(jié)果顯示，低壓缺氧刺激促進(jìn)SGZ的DCX陽性細(xì)胞表達(dá)，在SGZ，BrdU/DCX雙標(biāo)陽性細(xì)胞占所有BrdU陽性細(xì)胞的比例接近90%，而且在顆粒細(xì)胞層也發(fā)現(xiàn)少量雙標(biāo)陽性細(xì)胞。結(jié)果提示，新增殖的細(xì)胞大部分向神經(jīng)元方向分化，并可以向顆粒細(xì)胞層遷移。在低壓缺氧損傷后1～3天，BrdU陽性細(xì)胞除了在SGZ表達(dá)，在海馬的其他區(qū)域也大量出現(xiàn)，而GFAP也在低壓缺氧損傷后1～3天在海馬顆粒細(xì)胞周圍大量表達(dá)，BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞雖然在SGZ很少見，但在海馬神經(jīng)元周圍有較多的雙標(biāo)陽性細(xì)胞，而且這些雙標(biāo)陽性細(xì)胞高表達(dá)持續(xù)時間比較短暫。分析結(jié)果，在海馬齒狀回周圍大量的BrdU/GFAP雙標(biāo)陽性細(xì)胞應(yīng)該是反應(yīng)性增殖的星形膠質(zhì)細(xì)胞，而在SGZ，BrdU/GFAP 雙標(biāo)細(xì)胞數(shù)量很少。結(jié)果提示，增殖干細(xì)胞向膠質(zhì)細(xì)胞方向分化比例低。

高原低壓缺氧應(yīng)激刺激調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生的機(jī)制涉及多個方面，首先，缺氧應(yīng)激激活腎上腺糖皮質(zhì)激素信號途徑，產(chǎn)生的糖皮質(zhì)激素穿過血腦屏障與大腦許多區(qū)域的糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體結(jié)合發(fā)揮負(fù)反饋性調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，在海馬齒狀回有廣發(fā)分布的糖皮質(zhì)激素受體和鹽皮質(zhì)激素受體，但在在體和體外實驗發(fā)現(xiàn)，海馬部分前體細(xì)胞中只有糖皮質(zhì)激素受體而沒有鹽皮質(zhì)激素受體[14]，而實驗性敲除小鼠SGZ 區(qū)的糖皮質(zhì)激素受體，SGZ 區(qū)神經(jīng)細(xì)胞增殖和分化增多[15]。糖皮質(zhì)激素和受體結(jié)合后調(diào)節(jié)下游的相關(guān)基因，通過基因轉(zhuǎn)錄分析表明大量的信號通路受到影響，其中包括與成體神經(jīng)發(fā)生密切相關(guān)的信號通路，譬如Hedgehog 信號通路和TGF-β信號通路[16，17]等。其次，缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor1，HIF-1)是一種缺氧應(yīng)激性產(chǎn)物，在缺氧刺激后，穩(wěn)定表達(dá)的HIF-1激活其下游基因的表達(dá)[18]，其中包括VEGF、EPO、iNOS等超過100個下游基因的表達(dá)[19，20]。有這些基因編碼的蛋白參與多種病理生理過程：包括葡萄糖轉(zhuǎn)運及酵解；紅細(xì)胞生成；氧化應(yīng)激反應(yīng)；促炎或抗炎反應(yīng)；血管新生與重塑，以及中樞和周圍神經(jīng)再生等。實驗發(fā)現(xiàn)，在相對缺氧環(huán)境下，在SVZ、SGZ，BrdU陽性細(xì)胞數(shù)都明顯高于常氧環(huán)境；敲除HIF-1α 基因的大鼠生理狀態(tài)下NSCs數(shù)量可減少近50%[21]，結(jié)果提示干細(xì)胞增殖和HIF-1α的表達(dá)相關(guān)。缺氧應(yīng)激還可以通過調(diào)節(jié)Shh蛋白和Wnt蛋白等決定細(xì)胞分化和調(diào)節(jié)成體神經(jīng)發(fā)生的形態(tài)發(fā)生因子，可以激活SHH和Wnt信號通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)成體神經(jīng)發(fā)生。此外，缺氧刺激影響炎性分子等細(xì)胞因子和BDNF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的分泌，進(jìn)而通過相應(yīng)的信號分子調(diào)節(jié)成體神經(jīng)發(fā)生。

總之，急性低壓缺氧刺激可能通過多種途徑激活海馬齒狀回顆粒細(xì)胞下區(qū)NSCs的增殖，并促進(jìn)新生前體細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化，雖然存在增殖細(xì)胞數(shù)量較低，并且能夠存活下來整合到損傷神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞也較少，但其潛在的內(nèi)源性修復(fù)作用對缺氧應(yīng)激性腦損傷有一定的替代治療和腦保護(hù)作用。在今后的研究中，進(jìn)一步深入探索急慢性低壓缺氧刺激后神經(jīng)發(fā)生的調(diào)節(jié)機(jī)制，可為此類疾病的治療和藥物開發(fā)提供作用靶點。

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