杜 慧，趙 婧，韻海霞，劉永年，楊應(yīng)忠，3△

(1.青海大學(xué)研究生院，青海 西寧 810001；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810001；3.青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810001)

高原肺水腫(high altitude pulmonary edema，HAPE)發(fā)病機(jī)制迄今為止仍然不清楚，國內(nèi)外研究者們提出HAPE的發(fā)生是遺傳和環(huán)境雙重因素作用的結(jié)果，具有遺傳易感性[1]。與HAPE易感性相關(guān)的遺傳基礎(chǔ)研究多集中在eNOS、Hsp70、VEGF和血管緊張素及其受體、人白細(xì)胞抗原等基因的病例-對照關(guān)聯(lián)分析[2-3]，但是均未明確發(fā)現(xiàn)與HAPE發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)的遺傳基礎(chǔ)。

自2012年以來，課題組通過Affymetrix SNP 6.0芯片進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，篩選出在對照組與病例組間有顯著差異的SNP位點(diǎn)。本次研究選取其中5個(gè)SNPs位點(diǎn)，采用Sequenom MassARRAY?SNP分型技術(shù)檢測這些多態(tài)性位點(diǎn)，并分析與HAPE的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本次研究的HAPE患者(HAPE patient，HAPE-p)共133例，均為漢族，男性，平均年齡為40.20±9.91歲，無親緣關(guān)系。在青海省玉樹州援建時(shí)發(fā)病，并在玉樹州人民醫(yī)院確診為HAPE。這些患者平時(shí)體健，既往無高原病病史，無心血管疾病、糖尿病、先天性心臟病、基礎(chǔ)肺部疾病、肺發(fā)育不良等干擾本研究結(jié)果的疾病。健康對照組(HAPE-control，HAPE-c)135例，選取漢族，男性，既往體健，平均年齡為40.92±5.15歲，對其行常規(guī)體檢及有關(guān)生理指標(biāo)檢測。用統(tǒng)計(jì)表收集研究對象的一般情況。本研究經(jīng)青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院倫理審查委員會審查并通過，并與所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 儀器與材料

UVP凝膠成像系統(tǒng)(UVP公司)，DU800核酸檢測儀、5415D高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)，BIO-RAD PCR 擴(kuò)增儀( 美國伯樂)，DYY-6B型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京六一儀器廠)。Gentra Puregene Blood Kit血液基因組提取試劑盒(德國Qiagen158389)，1.5 mL EP管、200 μL PCR 管(AXYGEN SCIENTIFIC公司) 。其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 候選位點(diǎn)

前期GWAS結(jié)果提示這些基因與免疫調(diào)節(jié)炎癥、脂質(zhì)代謝、胞內(nèi)能量代謝、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)、鉀鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)、血管內(nèi)皮功能、肺臟發(fā)育、炎癥損傷等相關(guān)[4]。因此，篩選出以下5個(gè)SNP位點(diǎn)(表1)進(jìn)行分析。

表1候選SNPs信息表

Table 1 Information about Candidate SNPs

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 基因組DNA提取

分別抽取病例組和對照組外周靜脈血各4 mL，用EDTA鉀抗凝，離心(4000r/min)10 min，吸上層血漿至凍存管，置-80 ℃冰箱保存；吸取白細(xì)胞層至新的15 mL離心管，加入紅細(xì)胞裂解液混勻，充分裂解后離心棄上清液，重復(fù)上述步驟至只有白細(xì)胞，加入白細(xì)胞裂解液混勻，室溫保存。用Gentra Puregene Blood Kit基因組提取試劑盒，提取室溫保存的樣本中的白細(xì)胞基因組DNA，用核酸檢測儀測定濃度，并將樣本基因組DNA稀釋到200 ng/μL，樣本基因組DNA經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min后檢測條帶的完整性。置-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 基因分型

采用Sequenom MassARRAY?SNP分型檢測方法，通過多重PCR技術(shù)、iPLEX單堿基延伸技術(shù)、基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight，MALDI-TOF)進(jìn)行分型檢測。使用Sequenom 公司MassARRAY Assay Design及Genotyping Tools軟件設(shè)計(jì)待測SNP位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增引物及單堿基延伸引物，并交給生物公司合成。

1.4.3 PCR擴(kuò)增

利用多重PCR技術(shù)，反應(yīng)體系總體積為5 L。反應(yīng)體系(5μL)包含PCR master mix溶液、模板DNA 20-50 ng、Hotstar Taq 0.5 U，每條擴(kuò)增引物0.5 pmol，0.1 μL的25 mM dNTPs。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 3 min；4 ℃維持。為了去除體系中游離的dNTPs，在PCR反應(yīng)結(jié)束后，把PCR產(chǎn)物用SAP處理。將SAP Mix加入PCR反應(yīng)板，反應(yīng)體系總體積為7 μL，其中PCR產(chǎn)物5 μL，SAP混合液2 μL。PCR反應(yīng)條件：37 ℃ 40 min；85 ℃ 5 min；4 ℃維持。用堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積 9 μL，包含EXTEND Mix 2 μL，SAP處理后PCR產(chǎn)物7 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 30 s，4個(gè)循環(huán)(52℃ 5 s，80℃ 5 s)，39個(gè)循環(huán)(94℃ 5 s，52℃ 5 s，80℃ 5 s)，72 ℃ 3 min，4 ℃維持。在單堿基延伸反應(yīng)的結(jié)果中加入16 μL的水后將樹脂倒入孔中進(jìn)行純化，用MassARRAY Nanodispenser RS1000點(diǎn)樣儀進(jìn)行芯片點(diǎn)樣，最后使用MALDI-TOF分析，檢測結(jié)果使用TYPER 4.0軟件(sequenom)分型并輸出結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Excel 2013軟件行哈迪-溫伯格遺傳平衡檢驗(yàn)；應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，各基因型及等位基因頻率的比較采用卡方檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 候選SNPs分型結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)對268個(gè)樣本的SNP進(jìn)行分型(圖1)。Sequenom MassARRAY?SNP檢測是把SNP位點(diǎn)引起的堿基差異轉(zhuǎn)化成分子量大小的差異來體現(xiàn)，通過MALDI-TOF技術(shù)檢測延伸產(chǎn)物分子量的大小，應(yīng)用專用的分析軟件MassArray TYPER 4.0進(jìn)行處理，通過判斷分子量大小的差異來進(jìn)行SNP分型。

圖1根據(jù)分子量的差異判斷延伸產(chǎn)物分型結(jié)果

Figure1Thetypingresultoftheelongationproductdeterminesaccordingtothedifferenceofmolecularweight

2.2 Hardy-Weinberg檢驗(yàn)結(jié)果

分別對HAPE-p組和HAPE-c組行哈迪-溫伯格檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果顯示所有SNP位點(diǎn)均符合Hardy-Weinberg檢驗(yàn)平衡定律(P>0.05)，說明群體基因遺傳平衡(表2)。

表2 SNP哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)表

Table 2 SNP Hardy Weinberg equilibrium test

*：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導(dǎo)致表中HAPE組的兩個(gè)位點(diǎn)的實(shí)際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù)；**：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導(dǎo)致表中對照組各位點(diǎn)的實(shí)際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù).

2.3 候選SNPs基因型與等位基因頻率

rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433的基因型AA在HAPE組和對照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。同時(shí)，等位基因A在HAPE組中的頻率明顯高于對照組。rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456的隱性遺傳基因型AA+AG、AA+AT、AA+AC和AA+AG在HAPE組中的基因型頻率明顯高于對照組[OR(95%)為2.022(1.148-3.564)，P=0.014]、[OR(95%)為1.710(1.041-2.809)，P=0.033]、[OR(95%)為2.184(1.243-3.838)，P=0.006]、[OR(95%)為2.104(1.203-3.681)，P=0.008]。但是，rs2322433的隱性基因型AA+AG在HAPE組和對照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.184)。

表3候選SNPs位點(diǎn)在HAPE組與對照組中基因型及等位基因頻率分布表

Table 3Distribution of the Genotypic and Allelic Frequencies of the Candidate SNPs between HAPE and Healthy Groups

續(xù)表：

位點(diǎn)HAPE組(n=133)對照組(n=135)χ2POR(95%CI)rs1516386?/??AA22(20．37)11(13．25)7．0210．030AT64(59．26)61(73．49)TT44(40．74)63(75．90)A108(41．54)83(30．74)6．7000．0101．601(1．120-2．288)T152(58．46)187(69．26)AA22(16．92)11(8．15)4．6770．0312．296(1．065-4．951)AT+TT108(83．08)124(91．85)TT44(33．85)63(46．67)4．5220．0331．710(1．041-2．809)AA+AT86(66．15)72(53．33)rs474096??AA37(27．82)22(16．42)9．6400．008AC71(53．38)67(50．00)CC25(18．80)45(33．58)A145(54．51)111(41．42)9．1700．0021．695(1．203-2．387)C121(45．49)157(58．58)AA37(27．82)22(16．42)5．0410．0251．962(1．083-3．554)AC+CC96(72．18)112(83．58)CC25(18．80)45(33．58)7．5430．0062．184(1．243-3．838)AA+AC108(81．20)89(66．42)rs566456??AA34(25．56)22(16．54)8．0080．018AG73(54．89)66(49．62)GG26(19．55)45(33．83)A141(53．01)110(41．35)7．2490．0071．600(1．135-2．254)G125(46．99)156(58．65)AA34(25．56)22(16．54)3．2570．071AG+GG99(74．44)111(83．46)GG26(19．55)45(33．83)6．9360．0082．104(1．203-3．681)AA+AG107(80．45)88(66．17)rs2322433??AA50(37．59)32(24．06)5．9720．050AG58(43．61)67(50．38)GG25(18．80)34(25．56)A158(59．40)131(49．25)5．5220．0191．508(1．070-2．125)G108(40．60)135(50．75)AA50(37．59)32(24．06)5．7120．0171．901(1．119-3．231)AG+GG83(62．41)101(75．94)GG25(18．80)34(25．56)1．7640．184AA+AG108(81．20)99(74．44)

*：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導(dǎo)致表中HAPE組的兩個(gè)位點(diǎn)的實(shí)際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù)；**：由于檢測過程中部分樣本檢測失敗導(dǎo)致表中對照組各位點(diǎn)的實(shí)際檢測總數(shù)小于研究總例數(shù).

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，急進(jìn)高原后在調(diào)節(jié)血管通透性和血管舒縮功能及血管內(nèi)穩(wěn)態(tài)的多基因通路上發(fā)生了基因的異常表達(dá)，這些基因共同促進(jìn)肺動脈收縮效應(yīng)的放大和HAPE的發(fā)生發(fā)展，說明HAPE的發(fā)生是多基因調(diào)控的疾病[4]。然而，對于這些基因在不同學(xué)者的研究結(jié)果中的重復(fù)性并不一致，許多基因仍然需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。本研究針對前期工作選出的5個(gè)SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433的基因型頻率在HAPE組和對照組之間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

rs1193789、rs474096、rs566456位點(diǎn)位于11號染色體，分別位于編碼有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族中的SLC22A9和SLC22A10。SLC22A9在肝臟中高表達(dá)，是溶質(zhì)載體家族的一員，能被肝細(xì)胞核因子HNF-1α激活[5]。HNF-1α是細(xì)胞中肝細(xì)胞核因子(HNF)的一個(gè)亞型，HNF-1α在胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞中高表達(dá)，參與體內(nèi)葡萄糖及脂肪代謝的調(diào)節(jié)過程，是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在轉(zhuǎn)錄水平參與包括葡萄糖激酶在內(nèi)的多種蛋白質(zhì)的表達(dá)過程。

人類運(yùn)輸體溶質(zhì)載體家族，是基于序列的同源性和底物的專一性形成的有機(jī)陽離子交換器，及兩性離子協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由23個(gè)成員組成。他們在各種有機(jī)化合物腎臟的排泄中起著關(guān)鍵作用，這些有機(jī)化合物包括藥物、毒素和內(nèi)源性代謝物。藥物遺傳學(xué)研究清楚地表明，SLC22A轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在吸收、分發(fā)和消除各種內(nèi)源性化合物和藥物中扮演重要的角色。在溶質(zhì)載體蛋白中，SLC22A9對內(nèi)源性和外源性帶負(fù)電荷的陰離子化合物的消除或再吸收起著重要的作用[6-9]。

rs1193789位點(diǎn)的下游是葡萄糖易化轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白9基因(GLUT9/SLC2A9)，它與尿酸代謝密切相關(guān)，在尿酸重吸收中發(fā)揮重要的作用。目前，推測GLUT9的功能是將被吸收入腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)的尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)到腎間質(zhì)中，這一過程主要由位于基底膜側(cè)的GLU9L完成[10]。rs566456的下游基因是RTN3，它是RTN家族的成員之一，RTNs可參與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、調(diào)節(jié)β分泌酶活性及抑制神經(jīng)再生等過程。RTN3定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，通常被認(rèn)為是一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白，HAPE的發(fā)病中最主要的因素是缺氧，缺氧可以引起一系列生理病理過程，如凋亡、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白代謝、心臟興奮-收縮偶聯(lián)等。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成、折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，并且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度對維持細(xì)胞正常功能非常重要[11]。在哺乳動物細(xì)胞中，RTN3與Bcl-2結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，BCL-2家族蛋白對細(xì)胞內(nèi)Ca2+的調(diào)節(jié)可能通過以下兩種機(jī)制來實(shí)現(xiàn)：(1)調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中Ca2+的重新分布；(2)調(diào)控細(xì)胞凋亡中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫Ca2+的排空，所以在HAPE的發(fā)病過程中不均一性的離子通道的激活，如細(xì)胞膜的鈣離子通透性增加，均可導(dǎo)致肺動脈收縮及肺動脈壓力增高[11-12]。rs1516386位于3號染色體上，編碼細(xì)胞黏附分子CNTN4基因，是軸突相關(guān)黏附分子TAG-1/F3的亞組的一員，在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成、維持和可塑性中起重要作用。全縱長由6個(gè)免疫蛋白域和4個(gè)纖維蛋白(FNIII)域組成，通過糖基磷脂酰肌醇連接[12]。研究還發(fā)現(xiàn)，CNTN4在大腸直腸癌的生成和發(fā)展中具有抑癌的作用。rs1516386位點(diǎn)的下游基因?yàn)镮L-5。研究顯示，IL-5誘導(dǎo)嗜酸性粒細(xì)胞具有特異性，主要調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞生長、分化。炎癥反應(yīng)過程中的T淋巴細(xì)胞刺激支氣管黏膜產(chǎn)生的IL-5能選擇性作用于嗜酸性粒細(xì)胞，IL-5可引起肺嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多及支氣管收縮介質(zhì)反應(yīng)性增加，從而引起一系列肺部疾病[13]。人體快速進(jìn)入高原后，在低壓缺氧環(huán)境下，各種誘因引起的肺動脈壓力驟然升高，肺毛細(xì)血管靜水壓升高，血管收縮不平衡，收縮較弱的區(qū)域灌注增強(qiáng)，造成區(qū)域水腫，液體通過靠近阻力血管的動脈壁漏出、轉(zhuǎn)移和潴留，引起肺間質(zhì)和肺泡疾病。由此可見，炎性因子在HAPE的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色。

rs2322433位點(diǎn)的上游基因?yàn)镼KI，QKI基因?qū)儆赟TAR(signal transduction and activation of RNA)家族的一種RNA結(jié)合蛋白，它能與一些炎癥有關(guān)的靶分子，如VCAM，COX-2等結(jié)合。QKI基因含有9個(gè)外顯子，由于在進(jìn)化過程中高度保守，所以有一定的特異性，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和在胚胎發(fā)育中分別參與髓鞘發(fā)育和心血管系統(tǒng)發(fā)育，故大多數(shù)與QKI基因有關(guān)的研究集中在髓鞘發(fā)育的分子水平上；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胚胎心血管系統(tǒng)嚴(yán)重的發(fā)育障礙，是由QKI基因特定部位的突變導(dǎo)致的。對QKI基因啟動子序列分析發(fā)現(xiàn)其具有NF-κB的結(jié)合位點(diǎn)。NF-κB是一種對氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子，可以調(diào)節(jié)許多與炎癥有關(guān)的基因表達(dá)，來啟動炎癥的發(fā)生，在胚胎的發(fā)育過程中也扮演著不可或缺的角色。因此，NF-κB可在與炎癥有關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要的作用[14]。由此可見，基因改變在HAPE的發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，主要表現(xiàn)為，在低氧環(huán)境下與個(gè)體易感性密切相關(guān)。這些基因可能會成為一種重要的分子標(biāo)志物。

本次研究通過對HAPE患者rs1193789、rs1516386、rs474096、rs566456、rs2322433這5個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的分析，發(fā)現(xiàn)基因型AA和等位基因A可能是HAPE發(fā)生的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。在接下來的工作中，我們將繼續(xù)分析HAPE患者其他的多態(tài)性位點(diǎn)，探討研究與HAPE發(fā)病有關(guān)的其他危險(xiǎn)因素。

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