王學(xué)鋒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025)

·述評·

應(yīng)重視血栓與出血的實驗檢測

王學(xué)鋒

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院檢驗科，上海 200025)

國內(nèi)實驗室目前常規(guī)開展的血栓與出血檢測項目，多數(shù)是基于纖維蛋白形成為終點的檢測，對于不同出血病和血栓病診斷的敏感性和特異性有較大差異。血管性血友病因子(vWF)抗原、凝血因子Ⅷ活性、瑞斯托霉輔因子活性的檢測可以診斷多數(shù)的vWD，但精確分型還需結(jié)合其他試驗加以診斷和鑒別診斷。在凝血因子制劑替代治療、華法林等藥物抗凝治療、溶栓治療等方面，實驗室檢測可以判斷藥物治療無效和藥物拮抗過度。通過對遺傳性出血病或血栓病先證者實施基因檢測可以對家族中的疾病發(fā)生情況進行篩查。血栓與出血的實驗檢測可以為血栓病和出血病的診斷、療效監(jiān)測、個體化治療及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供重要依據(jù)。

血栓??；出血??；血管性血友??；凝血因子缺乏；抗凝蛋白缺陷；纖溶系統(tǒng)亢進

血栓病和出血病是臨床常見病和多發(fā)病，嚴重影響人類健康。血栓與出血的實驗室檢測可以為疾病的診斷、療效監(jiān)測、個體化治療及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供重要依據(jù)。

1 篩選試驗

目前，國內(nèi)實驗室常規(guī)開展的血栓與出血檢測項目，多數(shù)是基于纖維蛋白形成為終點的檢測。這些試驗對于不同出血病和血栓病診斷的敏感性和特異性有較大差異。

1.1出血病 臨床出血病最常用的篩選試驗為凝血酶原時間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)g)和血小板計數(shù)(platelet，PLT)。上述篩選試驗對出血病診斷的敏感性和特異性較高，絕大多數(shù)出血病可以發(fā)現(xiàn)異常。出血時間在初期止血診斷中有一定價值，但其敏感性及特異性不甚理想，臨床使用較為局限。PFA-100血小板功能分析儀是模仿機體一期止血而設(shè)計的檢測裝置，對初期止血功能缺陷的血小板數(shù)量和功能異常、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)等有較高的檢測價值[1]。在此基礎(chǔ)上升級改造的PFA-200血小板功能分析儀可以進一步監(jiān)測抗血小板藥物的有效性。血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)可以用于評價整體凝血狀況，但無法鑒別內(nèi)源或外源凝血系統(tǒng)的異常，一般以即時檢驗(point-of-care testing，POCT)的形式服務(wù)于臨床。

1.2血栓病 除部分血栓病患者可以有Fg升高，一般PT、APTT不甚敏感，僅少部分患者表現(xiàn)出該2項檢測的異常。TEG在血栓病可以表現(xiàn)為凝血因子激活時間(R)縮短，最大振幅(MA)增大，血塊形成時間(K)縮短和最大切角(α)增大，表現(xiàn)出較好的篩選價值。急性心肌梗死患者PFA-200血小板功能分析儀可以表現(xiàn)出閉孔時間(closure time，CT)縮短，并與心肌肌鈣蛋白T(cardiac troponin T，cTNT)和心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTNI)呈負相關(guān)。凝血酶生成試驗(thrombin generation test，TGT)可以準確檢測凝血酶的生成，在高凝狀態(tài)和血栓病時具有較高的敏感性。

1.3抗凝血系統(tǒng)的異常 APTT可以檢測出異?？鼓镔|(zhì)如狼瘡抗凝物質(zhì)、凝血因子Ⅷ(FⅧ)抗體等，但對于生理性抗凝蛋白如抗凝血酶(antithrombin，AT)、蛋白C(protein C，PC)、蛋白S(protein S，PS)異常患者，無法檢測到相應(yīng)改變。凝血酶時間(thrombin time，TT)可以檢測出體內(nèi)類肝素物質(zhì)增多。

1.4纖溶系統(tǒng)的異常 免疫比濁法檢測纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin/fibrinogen degradation products，F(xiàn)DP)和D-二聚體(D-dimmer，DD)可以給臨床提供信息。TEG在檢測纖溶亢進時也有特殊的圖形顯示，在原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶的診斷與鑒別診斷時有一定價值。

2 確診試驗

2.1先天性凝血因子缺乏癥 根據(jù)篩選試驗提供的線索直接檢測凝血因子可以明確疾病的診斷和鑒別診斷。vWD的發(fā)病率在所有遺傳性出血病中最高，直接檢測血管性血友病因子(von Willebrand factor，vWF)抗原、FⅧ活性、瑞斯托霉輔因子活性可以診斷多數(shù)的vWD。精確的分型往往需要進行vWF多聚體分析、膠原結(jié)合試驗、FⅧ和vWF結(jié)合試驗等加以診斷和鑒別診斷。對APTT延長、所有凝血因子檢測均正常、APTT糾正試驗陽性的情況，可以直接擴增激肽釋放酶原(prekallikrein，PK)和高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)的DNA。需要注意的是，我國目前廣泛使用的是凝血因子活性檢測的一期法。在FⅧ活性檢測時，多數(shù)情況下，一期法的結(jié)果和二期法吻合。但一些特殊情況下，如FⅧ基因突變，可以使二者結(jié)果出現(xiàn)差異[2]。

2.2抗凝蛋白缺陷 目前常用AT、PC、PS和組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)檢測抗凝蛋白缺陷，一般先檢測這些抗凝蛋白的活性，若有異常降低，再檢測其抗原性。根據(jù)活性與抗原性的改變，可以將抗凝蛋白缺陷分為交叉反應(yīng)物質(zhì)(cross reacting material，CRM)陽性(CRM+)和陰性(CRM-)2種，前者代表分子結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的功能異常，后者說明其合成減少。PS由于和補體C4結(jié)合蛋白結(jié)合后喪失活性，臨床上多通過檢測游離的PS來反映其抗凝活性。需要注意的是，并非所有的抗凝蛋白缺陷均可以通過目前的表型檢測方法發(fā)現(xiàn)；同樣，表型檢測所發(fā)現(xiàn)的異常，并非一定有病理診斷價值。Ding等[3]發(fā)現(xiàn)的PC的Thr315Ala是一個功能獲得性突變，導(dǎo)致PC在內(nèi)皮細胞膜上被激活加速，而其滅活FⅧa和FⅤa的能力下降，但綜合的抗凝功能仍較野生型增加。故雖然市售PC試劑檢測具有該突變的受試者是一個Ⅱ型PC缺陷患者，但其功能獲得性突變使其沒有血栓的癥狀，表現(xiàn)為一個表觀健康人。

2.3纖溶系統(tǒng)亢進 纖溶系統(tǒng)各成分的檢測有助于了解纖溶系統(tǒng)功能亢進的原因。由于先前的檢測方法復(fù)雜，很少應(yīng)用于臨床。日前，化學(xué)發(fā)光法將纖溶系統(tǒng)多個標志物如組織型纖溶酶原激活物-纖溶酶原激活物抑制劑1復(fù)合物(tissue plasminogen activator-plasminogen activator inhibitor-1 complex，t-PAIC)等應(yīng)用于自動化檢測中，大大提高了臨床檢測的效率。

3 療效監(jiān)測

療效監(jiān)測的主要體現(xiàn)：(1)在凝血因子制劑替代治療后觀察療效，同時可以為圍手術(shù)期個體化的精準止血方案提供實驗依據(jù)。(2)華法林抗凝治療時用國際標準化比值(international normalized ratio，INR)監(jiān)測已經(jīng)為眾多醫(yī)師所認可。肝素和低分子肝素抗凝治療時，需要了解AT水平以避免肝素抵抗，監(jiān)測抗FⅩa水平以達到最佳抗凝效果并避免出血風(fēng)險，檢測肝素-血小板第4因子(platelet factor 4，PF4)復(fù)合物抗體和PLT以避免肝素誘導(dǎo)的血小板減少癥/血栓形成。但這些檢測卻為廣大的醫(yī)務(wù)工作者所忽視。(3)監(jiān)測FDP和DD水平可以觀察溶栓治療藥物的效果,監(jiān)測PLT和Fg水平有助于減少出血風(fēng)險。(4)抗血小板治療監(jiān)測有傳統(tǒng)的光學(xué)法血小板聚集試驗、verifynow 的POCT檢測、VASP流式細胞術(shù)檢測及TEG的血小板圖檢測等多種方法學(xué)，各有其特點及優(yōu)勢。

通過檢測可以發(fā)現(xiàn)藥物治療無效和藥物拮抗過度的患者，有利于及時調(diào)整用藥以達到最佳的抗栓效益和最低的出血風(fēng)險。

4 藥物基因組學(xué)檢測

由于個體參與藥物代謝的基因多態(tài)性的差異，患者對不同藥物的敏感性不同。通過藥物基因組學(xué)的檢測，有助于了解藥物在患者體內(nèi)的代謝情況，真正做到精準用藥。目前常用的主要有華法林和氯吡格雷的藥物基因組學(xué)檢測,可以根據(jù)藥物基因組學(xué)檢測結(jié)果及時調(diào)整臨床用藥，以獲得最大的治療效果而最大程度避免藥物不良反應(yīng)的發(fā)生。

5 項目的優(yōu)化組合檢測

血栓與出血項目的檢測對于發(fā)現(xiàn)凝血紊亂，其敏感性和特異性不同。例如，對彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation, DIC)的診斷來說，敏感性高的如APTT、PT，特異性不強；反之，對DIC診斷特異性高的，如Fg和破碎紅細胞等，則敏感性堪憂。因此，DIC診斷時的項目優(yōu)化組合，在各個項目優(yōu)勢互補的前提下，可以使疾病的診斷效率大大提高。

6 基因檢測

遺傳性出血病與血栓病多為單基因疾病，通過對先證者實施基因檢測可以對家族中的疾病發(fā)生情況進行篩查。血友病為最常見的遺傳性出血性疾病，為FⅧ/FⅨ的數(shù)量或功能異常所導(dǎo)致。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院通過直接檢測FⅧ/FⅨ基因缺陷，聯(lián)合FⅧ/FⅨ基因內(nèi)外多個位點的多態(tài)性進行遺傳連鎖分析，已成功實施1 700余例，鑒別出正常胎兒、女性攜帶者及血友病患者[4]。

遺傳性血栓病的基因診斷同樣可以為部分血栓病患者找到病因，以指導(dǎo)診斷及優(yōu)生優(yōu)育。瑞金醫(yī)院將凝血因子、抗凝蛋白及有關(guān)纖溶因子及無表型檢測(PROCR、THBD、ADAMTS13、HRG、SERPIND1、TFPI)的相關(guān)基因計15個組成檢測panel，通過二代測序、基因拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)檢測及cDNA檢測，發(fā)現(xiàn)入組的血栓病患者除42.4%由單基因突變導(dǎo)致外，27.25%由雙基因突變、11.1%由三基因突變導(dǎo)致，多數(shù)由數(shù)個不同的基因缺陷導(dǎo)致，26.25%尚未發(fā)現(xiàn)基因突變。

7 表型結(jié)合基因型的診斷

表型結(jié)合基因型的診斷策略可以使血栓病和出血病的診斷更加精準。Liang等[5]將此策略用于vWD的診斷，可以使疾病的亞型分類更加精細，除發(fā)現(xiàn)部分患者同時有幾種亞型的表現(xiàn)，還發(fā)現(xiàn)少數(shù)患者同時合并有血友病A。另外，女性血友病A患者非常罕見。陸曄玲等[6]結(jié)合表型與基因型的診斷策略，診斷出3個血友病A女性患者。

8 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究

血栓病和出血病是轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究的極好對象。通常情況下，當凝血因子基因發(fā)生功能缺失性突變時，往往會造成出血病；反之，當抗凝蛋白基因發(fā)生功能缺失性突變時，往往可以造成血栓形成。然而，凝血因子的功能獲得性突變可以導(dǎo)致患者血液凝固性異常增高，導(dǎo)致血栓形成。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院在日常工作中發(fā)現(xiàn)一位靜脈血栓患者的FⅨ的基因1151G/A突變導(dǎo)致FⅨ氨基酸替換，即FⅨ Arg384Gln FⅨ R384Q(含信號肽編碼)或FⅨ R338Q(經(jīng)典編碼)。突變后的FⅨ的凝血活性較野生型高出5倍。這是繼FⅨ Arg384Leu FⅨ Padua后人類發(fā)現(xiàn)的又一個凝血因子的功能獲得性突變。前者已經(jīng)成功地應(yīng)用于血友病B的基因治療并獲成功。后者被本課題組命名為FⅨ Shanghai，通過AAV8載體已經(jīng)在血友病B小鼠中獲得了長期的高表達。期待FⅨ Shanghai作為具有獨立知識產(chǎn)權(quán)的突變在血友病B的基因治療上有所突破。除此之外，F(xiàn)Ⅸ Shanghai所表達的FⅨ有望與清蛋白或免疫球蛋白的Fc端結(jié)合，形成高效的半衰期長的凝血因子制劑。

血栓與出血的深入研究，不僅給疾病的診斷與治療帶來了巨大的改進，也為疾病發(fā)病機制的研究及轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究提供了更加廣闊的平臺。

[1]Lassila R.Platelet function tests in bleeding disorders[J]. Semin Thromb Hemost, 2016,42(3):185-190.

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[3]Ding Q, Yang L, Dinarvand P,etal.Protein C Thr315Ala variant results in gain of function but manifests as type Ⅱ deficiency in diagnostic assays[J].Blood, 2015,125(15):2428-2434.

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[5]Liang Q, Qin H, Ding Q,etal. Molecular and clinical profile of vWD in a large cohort of Chinese population: application of next generation sequencing and CNVplex?technique[J].Thromb Haemost,2017,117(8):1534-1548.

[6]陸曄玲，丁秋蘭，戴菁，等.FⅧ基因內(nèi)含子22倒位及X染色體非隨機滅活導(dǎo)致的女性血友病A[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(5):528-532.

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.02

王學(xué)鋒，1963年生，男，教授，主任醫(yī)師，博士，主要從事出血病、血栓病的診治工作和研究，E-mail：13641653074@139.com。

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