王嬋娟，楊碩，張捷，喬蕊

(北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191)

·臨床實(shí)驗(yàn)研究·

達(dá)比加群服藥患者出血風(fēng)險(xiǎn)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)

王嬋娟，楊碩，張捷，喬蕊

(北京大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100191)

目的觀察常規(guī)凝血試驗(yàn)結(jié)果與血漿達(dá)比加群濃度的相關(guān)性，尋找合適的試驗(yàn)用于監(jiān)測(cè)達(dá)比加群服藥患者的出血風(fēng)險(xiǎn)。方法分析北京大學(xué)第三醫(yī)院2015年至2017年使用達(dá)比加群抗凝的49名非瓣膜性心房顫動(dòng)(NVAF)患者的臨床資料，并計(jì)算其出血發(fā)生率。收集20名健康志愿者的血漿，制成正?；旌涎獫{(NPP)，分別向1 mL NPP中加入0～1 000 ng/mL濃度梯度的達(dá)比加群，檢測(cè)凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(Fib)和稀釋蝰蛇毒時(shí)間(dRVVT)。另外收集3名健康志愿者的新鮮全血，做相同的加藥處理后進(jìn)行血栓彈力圖試驗(yàn)(TEG)。結(jié)果服用達(dá)比加群的NVAF患者的出血發(fā)生率高達(dá)28.6%，以消化道出血居多。APTT、dRVVT、TEG的 R時(shí)間(R)和凝血指數(shù)(CI)結(jié)果與血漿達(dá)比加群濃度相關(guān)性良好，其中，dRVVT的敏感性最強(qiáng)，APTT次之，R和CI敏感性較差。結(jié)論APTT和dRVVT在監(jiān)測(cè)達(dá)比加群出血事件方面具有重要意義，將有助于臨床尋找合適的停藥時(shí)機(jī)，減少出血事件的發(fā)生。

達(dá)比加群；活化部分凝血活酶時(shí)間；稀釋蝰蛇毒時(shí)間；血栓彈力圖；出血事件

達(dá)比加群是一種新型的口服抗凝藥，通過(guò)結(jié)合凝血酶的活性位點(diǎn)抑制其活性，從而阻斷凝血瀑布反應(yīng)的最后階段，防止血栓形成；另外，它還能抑制血小板的聚集[1]。目前，達(dá)比加群被批準(zhǔn)用于非瓣膜性心房顫動(dòng)(nonvalvular atrial fibrillation，NVAF)患者卒中和全身性血栓的預(yù)防，臨床應(yīng)用日益廣泛[2]。與華法林相比，達(dá)比加群具有作用快、半衰期短、藥物食物相互作用少以及藥物代謝動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此臨床上以固定劑量給藥且不需要常規(guī)監(jiān)測(cè)[3]。長(zhǎng)期抗凝治療的隨機(jī)性評(píng)價(jià)(randomised evaluation of long-term anticoagulation therapy, RE-LY)研究通過(guò)比較不同口服抗凝藥的安全性和有效性指出，達(dá)比加群導(dǎo)致的出血事件發(fā)生率低于華法林，特別是大出血和顱內(nèi)出血事件[4]。但近年來(lái)關(guān)于達(dá)比加群服藥患者出血事件的報(bào)道越來(lái)越多，特別是消化道出血事件的發(fā)生率較高，給臨床用藥帶來(lái)一定的困惑。目前，許多研究正致力于尋找合適的凝血試驗(yàn)以監(jiān)測(cè)達(dá)比加群的抗凝活性，降低出血事件的發(fā)生率。其中，Ecarin凝血時(shí)間(Ecarin clotting time，ECT)和稀釋凝血酶時(shí)間(diluted thrombin time，dTT)測(cè)定法在治療范圍內(nèi)與血漿達(dá)比加群濃度的相關(guān)性好，是推薦的達(dá)比加群監(jiān)測(cè)試驗(yàn)[5-6]，但由于二者尚未標(biāo)準(zhǔn)化，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)相應(yīng)的試劑，無(wú)法在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室中開(kāi)展。Korostelev等[7]研究認(rèn)為，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是檢測(cè)血漿達(dá)比加群濃度快而有效的方法，但其方法較復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，不適用于常規(guī)檢測(cè)。因此，評(píng)價(jià)現(xiàn)有的常規(guī)凝血功能試驗(yàn)對(duì)達(dá)比加群出血事件的監(jiān)測(cè)能力有更多實(shí)踐意義。Reilly等[8]研究表明，血漿達(dá)比加群水平與出血風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)。本研究通過(guò)外源性加藥的方式模擬血漿達(dá)比加群濃度，并使其覆蓋治療濃度和過(guò)量濃度，通過(guò)分析其對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)結(jié)果的影響，篩選恰當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)室指標(biāo)用于監(jiān)測(cè)達(dá)比加群的出血風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料和方法

1.1研究對(duì)象 連續(xù)選擇2015年至2017年在北京大學(xué)第三醫(yī)院住院的服用達(dá)比加群抗凝的NVAF患者49例，排除瓣膜性心房顫動(dòng)、使用華法林等其他抗凝藥物、服用達(dá)比加群前即有出血事件發(fā)生的患者，分析其臨床資料，包括年齡、性別、體重、腎功能、基礎(chǔ)疾病、用藥等，并通過(guò)病例查詢或電話回訪確定患者是否發(fā)生出血事件及其出血部位?；颊咴诜幤陂g發(fā)生出血事件為隨訪終點(diǎn)。本研究通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均知情同意。

1.2主要儀器與試劑 ACL-TOP 700全自動(dòng)血凝分析儀(西班牙Werfen公司)，Haemoscope 5000分析儀及其配套試劑(美國(guó)Haemonetics公司)；達(dá)比加群BIBR953(批號(hào)S2196，美國(guó)Selleckchem公司)，凝血四項(xiàng)試劑、狼瘡抗凝物測(cè)定試劑盒(美國(guó)Instrumentation Laboratory公司)。

1.3標(biāo)本采集與處理 采集20名健康志愿者(男5例，女15例，平均年齡38歲)清晨空腹靜脈血，枸櫞酸鈉抗凝，混勻后3 000 r/min離心10 min，收集新鮮抗凝血漿各2 mL，混勻形成正?；旌涎獫{(normal pooled plasma，NPP)40 mL。同時(shí)收集3名健康志愿者的新鮮全血各10 mL，枸櫞酸鈉抗凝。入選標(biāo)準(zhǔn)：近2周內(nèi)未服用抗凝藥物，無(wú)血栓和出血相關(guān)基礎(chǔ)疾病，凝血檢查無(wú)異常。

將NPP和新鮮全血各990 μL分裝于EP管中，分別加入不同劑量的溶解于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)的達(dá)比加群活性藥物，達(dá)比加群的終濃度分別為0、25、50、100、200、400、600、800和1 000 ng/mL。每個(gè)EP管的終體積為1 mL，最終每管溶液中DMSO所占的體積比均為1∶100。

1.4常規(guī)凝血試驗(yàn) 用ACL-TOP 700血凝分析儀檢測(cè)加入達(dá)比加群活性藥物的NPP，分析凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)、纖維蛋白原(fibrinogen，F(xiàn)ib)、稀釋蝰蛇毒時(shí)間(diluted Russell viper venom time，dRVVT)。在Haemoscope 5000分析儀上用加入達(dá)比加群活性藥物的新鮮全血進(jìn)行血栓彈力圖(thromboelastogram，TEG)試驗(yàn)，分析TEG凝血因子激活時(shí)間(R)、血塊形成時(shí)間(K)、最大切角(α angle，α)、最大振幅(maximum amplitude，MA)和凝血指數(shù)(clot index，CI)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)算出血發(fā)生率，分析TT、PT、APTT、Fib、dRVVT、TEG結(jié)果與血漿達(dá)比加群濃度的相關(guān)性。以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1出血發(fā)生率 49例患者與RE-LY研究[8]的人群特征見(jiàn)表1。隨訪49例服用達(dá)比加群抗凝的NVAF患者發(fā)現(xiàn)，14例在服藥期間發(fā)生了不同程度的出血，總出血發(fā)生率約28.6%，出血部位包括消化道(7例)、尿道(2例)、呼吸道(2例)、顱內(nèi)(1例)和皮膚黏膜(2例)。其中，以消化道出血居多，約占50%。

表1 本研究與RE-LY研究[8]的人群特征

2.2達(dá)比加群對(duì)凝血四項(xiàng)的影響 TT和Fib對(duì)達(dá)比加群過(guò)于敏感，在血漿達(dá)比加群濃度達(dá)到50 ng/mL時(shí)，TT超過(guò)檢測(cè)上限，當(dāng)濃度達(dá)到100 ng/mL時(shí)，凝血酶法(Clauss法)測(cè)定的Fib低于檢測(cè)下限。PT對(duì)血漿達(dá)比加群濃度變化不夠敏感，在低濃度時(shí)曲線變化緩慢，見(jiàn)圖1，其回歸方程為Y=0.015X+

9.5(r=0.967，P<0.01)(Y為PT值，X為血漿達(dá)比加群濃度)。APTT隨血漿達(dá)比加群濃度增加而延長(zhǎng)，二者呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，特別是在治療濃度范圍內(nèi)，而當(dāng)高于治療濃度時(shí)曲線變緩，見(jiàn)圖1，其回歸方程為Y=0.063X+38.388(r=0.982，P<0.01)(Y為APTT值，X為血漿達(dá)比加群濃度)。

圖1 血漿達(dá)比加群濃度對(duì)PT、APTT的影響

2.3達(dá)比加群對(duì)dRVVT的影響 見(jiàn)圖2。dRVVT篩查試驗(yàn)(dRVVT-S)和dRVVT確證試驗(yàn)(dRVVT-C)均隨血漿達(dá)比加群濃度升高而延長(zhǎng)，在治療濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，而超過(guò)治療濃度后變化不顯著，其回歸方程分別為Y=0.094X+49.957(r=0.913，P<0.01)和Y=0.11X+44.205(r=0.935，P<0.01)，Y分別為dRVVT-S和dRVVT-C結(jié)果，X為血漿達(dá)比加群濃度。

圖2 血漿達(dá)比加群濃度對(duì)dRVVT的影響

2.4達(dá)比加群對(duì)TEG結(jié)果的影響 見(jiàn)圖3。R值隨血漿達(dá)比加群濃度升高而延長(zhǎng)，CI值隨血漿達(dá)比加群濃度升高而降低，二者均呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)性，其回歸方程分別為Y=0.009X+5.968(r=0.957，P<0.01)和Y=-0.008X-0.483(r=0.974，P<0.01)，Y分別為R和CI值，X為血漿達(dá)比加群濃度。α和K雖然在血漿達(dá)比加群濃度200 ng/mL之后隨濃度呈線性變化，但二者始終在參考區(qū)間內(nèi)，其回歸方程分別為Y=-0.015X+65.677(r=0.952，P<0.01)和Y=0.001X+1.894(r=0.936，P<0.01)，Y分別為α和K值，X為血漿達(dá)比加群濃度。MA與血漿達(dá)比加群濃度沒(méi)有相關(guān)性。

2.5常規(guī)凝血試驗(yàn)對(duì)血漿達(dá)比加群濃度變化的敏感性 見(jiàn)表2。將血漿達(dá)比加群濃度與凝血試驗(yàn)結(jié)果同時(shí)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后進(jìn)行相關(guān)回歸分析(X為以10為底數(shù)的血漿達(dá)比加群濃度的對(duì)數(shù)，Y分別為以10為底數(shù)的APTT、R、dRVVT-S、dRVVT-C的對(duì)數(shù))，回歸方程的系數(shù)越大說(shuō)明敏感性越高，dRVVT的敏感性最高，尤其是dRVVT-C，其次是APTT，而R值的敏感性最小。

表2 經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后血漿達(dá)比加群濃度與常規(guī)凝血試驗(yàn)的相關(guān)性

指標(biāo)回歸方程r(P)APTTY=0.264X+1.1670.991(<0.01)RY=0.251X+0.3900.987(<0.01)dRVVT-SY=0.317X+1.1790.985(<0.01)dRVVT-CY=0.331X+1.1310.989(<0.01)

3 討論

盡管RE-LY研究[8]認(rèn)為，達(dá)比加群的藥物代謝動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定，其出血發(fā)生率明顯低于華法林，但其臨床出血事件仍時(shí)有發(fā)生。本研究通過(guò)臨床隨訪得出，達(dá)比加群服藥患者中出血發(fā)生率約為28.6%，高于RE-LY研究[8]。通過(guò)與RE-LY研究[8]的人群特征比較發(fā)現(xiàn)，本研究人群體重偏低，高血壓和糖尿病等基礎(chǔ)疾病較多且44.9%有卒中史，提示基線水平差異會(huì)導(dǎo)致出血風(fēng)險(xiǎn)不同?？紤]到國(guó)內(nèi)服用達(dá)比加群進(jìn)行抗凝的多為有基礎(chǔ)疾病的老年人，而RE-LY研究[8]指出，高齡(≥75歲)、低體重、糖尿病等是出血發(fā)生的高危因素。因此，對(duì)于出血高風(fēng)險(xiǎn)的服藥患者有必要適時(shí)地監(jiān)測(cè)血漿達(dá)比加群濃度以判斷正確的停藥時(shí)機(jī)，對(duì)于判斷服藥中出血是否由達(dá)比加群引起也有提示作用。

圖3 血漿達(dá)比加群濃度對(duì)TEG結(jié)果的影響

通過(guò)觀察凝血四項(xiàng)監(jiān)測(cè)血漿達(dá)比加群濃度發(fā)現(xiàn)，TT和Fib對(duì)血漿達(dá)比加群濃度變化太過(guò)于敏感，這是由于達(dá)比加群直接抑制試劑中凝血酶活性。PT隨血漿達(dá)比加群濃度升高呈指數(shù)而變化，初始時(shí)對(duì)濃度變化的敏感性較差，而隨著血漿達(dá)比加群濃度的升高，單憑PT值將會(huì)高估出血風(fēng)險(xiǎn)，給臨床造成誤解。因此，三者均不適用于達(dá)比加群的監(jiān)測(cè)。APTT對(duì)血漿達(dá)比加群濃度變化比較敏感，在治療濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)關(guān)系，與Douxfils等[9]研究結(jié)果一致。另外，Lindahl等[10]研究認(rèn)為，不同APTT試劑對(duì)血漿達(dá)比加群濃度變化的反應(yīng)相似。

目前，在臨床上dRVVT主要用于狼瘡抗凝物的檢測(cè)。本研究發(fā)現(xiàn)，與APTT結(jié)果類似，dRVVT與血漿達(dá)比加群濃度在治療范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)關(guān)系，其敏感性高于APTT，尤其是dRVVT-C。Colombini等[11]研究發(fā)現(xiàn)，dRVVT與利伐沙班血漿濃度也有良好的相關(guān)性，其敏感性高達(dá)100%，提示dRVVT在口服抗凝藥出血監(jiān)測(cè)方面具有潛在價(jià)值。

對(duì)于TEG，Solbeck等[12]發(fā)現(xiàn)，R值與ECT試驗(yàn)有很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.914,P<0.01)。本研究發(fā)現(xiàn)，R和CI與血漿達(dá)比加群濃度呈現(xiàn)良好的線性相關(guān)關(guān)系，但是其敏感性較dRVVT和APTT低；K和α雖然隨血漿達(dá)比加群濃度有變化趨勢(shì)，但二者始終在參考區(qū)間內(nèi)，因此其提示作用較弱，不易引起臨床醫(yī)生的注意；MA與血漿達(dá)比加群濃度沒(méi)有相關(guān)性。這可以用TEG反應(yīng)的原理來(lái)解釋上述結(jié)果：R和CI反映的是凝血因子的活性，而K、α和MA主要反映纖維蛋白原和血小板的功能[13]。雖然TEG可以反映機(jī)體整個(gè)凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的功能，在血栓和出血疾病的監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用，但其檢驗(yàn)費(fèi)用較高，而且不可能單獨(dú)檢測(cè)R和CI兩個(gè)指標(biāo)，考慮到經(jīng)濟(jì)效益比，不推薦其作為達(dá)比加群監(jiān)測(cè)的首選。

綜上所述，某些特定人群服用達(dá)比加群時(shí)出血發(fā)生率較高，因此監(jiān)測(cè)達(dá)比加群具有重要的臨床價(jià)值。本研究通過(guò)比較常規(guī)凝血試驗(yàn)與血漿達(dá)比加群濃度的相關(guān)性，并結(jié)合經(jīng)濟(jì)效益等因素綜合考慮，推薦APTT和dRVVT作為達(dá)比加群的監(jiān)測(cè)試驗(yàn)，超過(guò)第90百分位數(shù)的達(dá)比加群谷濃度(約200 ng/mL)時(shí)測(cè)得的APTT和dRVVT考慮與出血風(fēng)險(xiǎn)增高相關(guān)，可以指導(dǎo)臨床適時(shí)地停藥。

[1]Aalbers J, Bryer A, Klug E. FDA committee unanimously recommends approval of dabigatran etexilate for stroke prevention in atrial fibrillation [J]. Cardiovasc J Afr, 2010, 21(6): 341.

[2]Wolowacz SE, Roskell NS, Plumb JM,etal. Efficacy and safety of dabigatran etexilate for the prevention of venous thromboembolism following total hip or knee arthroplasty—A Meta-analysis[J]. Thromb Haemost, 2009, 101(1): 77-85.

[3]Bounameaux H, Reber G. New oral antithrombotics: a need for laboratory monitoring. Against[J]. J Thromb Haemost, 2010, 8(4): 627-630.

[4]Wallentin L, Yusuf S, Ezekowitz MD,etal. Efficacy and safety of dabigatran compared with warfarin at different levels of international normalised ratio control for stroke prevention in atrial fibrillation: an analysis of the RE-LY trial[J]. Lancet, 2010, 376(9745): 975-983.

[5]Du S, Weiss C, Christina G,etal. Determination of dabigatran in plasma, serum, and urine samples: comparison of six methods[J]. Clin Chem Lab Med, 2015, 53(8):1237-1247.

[6]Cuker A, Siegal DM, Crowther MA,etal. Laboratory measurement of the anticoagulant activity of the non-vitamin K oral anticoagulants[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 64(11):1128-1139.

[7]Korostelev M, Bihan K, Ferreol L,etal. Simultaneous determination of rivaroxaban and dabigatran levels in human plasma by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. J Pharm Biomed Anal, 2014, 100(Supplement C): 230-235.

[8]Reilly PA, Lehr T, Haertter S,etal. The effect of dabigatran plasma concentrations and patient characteristics on the frequency of ischemic stroke and major bleeding in atrial fibrillation patients: the RE-LY Trial (Randomized Evaluation of Long-Term Anticoagulation Therapy)[J]. J Am Coll Cardiol, 2014, 63(4): 321-328.

[9]Douxfils J, Mullier F, Robert S,etal. Impact of dabigatran on a large panel of routine or specific coagulation assays[J]. Thromb Haemost, 2012, 107(5): 985-997.

[10]Lindahl TL, Baghaei F, Blixter IF,etal. Effects of the oral, direct thrombin inhibitor dabigatran on five common coagulation assays[J]. Thromb Haemost, 2011, 105(2): 371-378.

[11]Colombini MP, Derogis PBMC, de Aranda VF,etal. Comparison of different laboratory tests in the evaluation of hemorrhagic risk of patients using rivaroxaban in the critical care setting: diagnostic accuracy study[J]. Thromb J, 2017, 15:21.

[12]Solbeck S, Ostrowski SR, Stensballe J,etal. Thrombelastography detects dabigatran at therapeutic concentrations in vitro to the same extent as gold-standard tests[J]. Int J Cardiol, 2016, 208(Supplement C):14-18.

[13]Solbeck S, Meyer MA, Johansson PI,etal. Monitoring of dabigatran anticoagulation and its reversal in vitro by thrombelastography[J]. Int J Cardiol, 2014, 176(3): 794-799.

LaboratorymeasurementofbleedingriskforpatientsreceivingDabigatran

WANGChan-juan,YANGShuo,ZHANGJie,QIAORui

(DepartmentofLaboratoryMedicine,PekingUniversityThirdHospital,Beijing100191,China)

ObjectiveTo observe the correlation between conventional coagulation tests and Dabigatran concentration in order to find proper test method to predict the bleeding risk of patients receiving Dabigatran.MethodsThe clinical data of forty-nine non-valvular atrial fibrillation (NVAF) patients who took Dabigatran in Peking University Third Hospital from 2015 to 2017 were analyzed and the bleeding rates were calculated. The plasma samples from twenty healthy volunteers were collected and mixed up into normal pooled plasma (NPP). Different doses of active Dabigatran were mixed with NPP, making Dabigatran concentrations from 0 to 1 000 ng/mL. Prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT), fibrinogen (Fib) and diluted Russell viper venom time (dRVVT) were determined. Fresh whole blood samples from three normal volunteers were collected and mixed with Dabigatran in the same way to perform thromboelastogram (TEG).ResultsThe total bleeding rate of NVAF patients receiving Dabigatran was 28.6%, among which gastrointestinal bleeding accounts for the most. APTT, dRVVT, R time (R) and clot index (CI) showed a good linear correlation with Dabigatran concentration. The sensitivity of dRVVT was the best, followed by APTT. R and CI showed low sensitivity compared with APTT and dRVVT.ConclusionAPTT and dRVVT should be good parameters for monitoring the bleeding risk of Dabigatran and helpful for physicians to choose proper point-in-time for withdrawal of Dabigatran and reduce bleeding events.

Dabigatran; activated partial thromboplastin time; diluted Russell viper venom time; thromboelastogram; bleeding event

10.13602/j.cnki.jcls.2017.12.08

國(guó)家自然科學(xué)基金(81601824)。

王嬋娟，1992年生，女，碩士研究生，主要從事血栓與止血研究。

喬蕊，副教授，E-mail：qrqiaorui@163.com。

R446.11;R619

A

2017-10-09)

王海燕)