魏春紅，盛艷，吳澤柱

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.馬利酵母有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱150300）

耐高溫酒用酵母發(fā)酵生長(zhǎng)條件的優(yōu)化

魏春紅1，盛艷2，吳澤柱2

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江大慶163319；2.馬利酵母有限責(zé)任公司，黑龍江哈爾濱150300）

對(duì)耐高溫酵母生長(zhǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化研究。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明：該菌種最適生長(zhǎng)溫度32℃，pH 6.0，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)750 r/min，接種量7.0%。在上述生長(zhǎng)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化結(jié)果：溫度34℃，pH 5.0，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)800 r/min，接菌量5.0%，優(yōu)化后OD560值為1.315。

耐高溫；酒用酵母；生產(chǎn)條件

酵母菌廣泛應(yīng)用在釀造、發(fā)酵食品、石油代糧發(fā)酵、單細(xì)胞蛋白質(zhì)、發(fā)酵飼料等工業(yè)。還可從酵母菌中提取醫(yī)藥、化工方面需要的一些重要原料，有廣泛用途[1]。在自然界中，酵母菌多分布在含糖量高，偏酸性的環(huán)境中，是一種兼性厭氧性微生物，在有氧條件下好生長(zhǎng)，大量繁殖。

酒用酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，不僅因?yàn)閭鹘y(tǒng)上它用作釀酒，在現(xiàn)代分子和細(xì)胞生物學(xué)中用作真核模式生物，其作用相當(dāng)于原核的模式生物大腸桿菌[2]。酒用酵母是發(fā)酵中最常用的生物種類。細(xì)胞為球形或者卵形，直徑5μm～10μm[3]。酒用酵母是以糖蜜為原料，經(jīng)過(guò)發(fā)酵通風(fēng)培養(yǎng)的釀酒酵母、葡萄酵母、貝酵母等所制得的有發(fā)酵產(chǎn)酒能力的釀酒活性的酵母，其繁殖的方法為出芽生殖[4]。

在傳統(tǒng)白酒發(fā)酵過(guò)程中，當(dāng)通氣充分時(shí)，酵母菌進(jìn)行好氧呼吸，代謝能力強(qiáng)、速度快、菌體生長(zhǎng)繁殖旺盛；在厭氧發(fā)酵階段的厭氣條件下，進(jìn)行厭氧呼吸，經(jīng)厭氧乙醇發(fā)酵代謝途徑，發(fā)酵產(chǎn)生乙醇及相關(guān)發(fā)酵產(chǎn)物[5]。

在我國(guó)傳統(tǒng)的白酒生產(chǎn)過(guò)程中，原糧糟存在淀粉利用不徹底的問(wèn)題，如何提高原糧糟的淀粉利用率和降低能耗是困擾白酒行業(yè)的一個(gè)難題。酒用干酵母可有效提高原糧糟的淀粉利用率，提高出酒率，縮短發(fā)酵周期，可以彌補(bǔ)發(fā)酵力的不足，強(qiáng)化發(fā)酵，可凈化微生物體系，保障生產(chǎn)，此外還具有耐高溫、耐酒精、耐酸、耐濃糖、出酒率高等優(yōu)點(diǎn)[6-7]。因此，分析酒用酵母的特性對(duì)白酒生產(chǎn)以及充分發(fā)揮其代謝發(fā)酵生產(chǎn)能力，提高白酒發(fā)酵原料利用率及白酒發(fā)酵生產(chǎn)率，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

Y1359：由AB-Mauri公司GTG（Global Technology Group at Australia）研發(fā)機(jī)構(gòu)提供。

1.2 材料與試劑

糖蜜：訥河紅光糖廠采購(gòu)甜菜蜜。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸膏：青島海博生物科技有限公司；硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鋅、磷酸一銨：天津北辰方正試劑廠；維生素B1、維生素B6：天津市志遠(yuǎn)試劑有限公司；生物素、泛酸鈣：同泰唯潤(rùn)生物科技有限公司。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基（%）：葡萄糖0.1，蛋白胨0.5，酵母浸膏0.5，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（%）：糖蜜5.0，硫酸銨0.3，磷酸一銨0.04，硫酸鎂0.03，硫酸鋅0.002，維生素B10.000 3，維生素B60.002，泛酸鈣0.000 7，生物素0.000 1，pH 7.0。

1.3 儀器與設(shè)備

SpectrumLab752s紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海棱光技術(shù)有限公司；LDZX-25型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；pHS-3C型精密pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HZQ-QX型恒溫振蕩器：中國(guó)哈爾濱東聯(lián)儀器有限公司；BCN-1360生物潔凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司；Cplus-10-3賽多利斯BioSTATA生物反應(yīng)器：德國(guó)賽多利斯公司。

1.4 菌種活化

將Y1359斜面菌種轉(zhuǎn)接到裝有100mL種子培養(yǎng)基小三角瓶中，靜置活化培養(yǎng)18 h。將活化菌種按5%的接種量加入1 000mL大三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中。靜置活化培養(yǎng)18 h。

1.5 淀粉出酒率的測(cè)定[8]

根據(jù)國(guó)標(biāo)法GB/T 20886-2007《食用加工用酵母》檢測(cè)耐高溫酵母淀粉出酒率。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定[8]

將活化的菌液按照5%接種量接于10 L生物發(fā)酵中，在pH 7、28℃、650 r/min條件下，每隔2 h測(cè)定培養(yǎng)液OD560值，根據(jù)OD560值繪制酵母菌生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 酒用酵母生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of wine yeast

由圖1可以看出，Y1359在10 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，25 h進(jìn)入穩(wěn)定期，36 h進(jìn)入衰亡期。因此，可以選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的中期作為后續(xù)試驗(yàn)中OD560值的測(cè)定時(shí)間，定為18 h。

2.2 溫度對(duì)酵母產(chǎn)量的影響

按照5.0%的接種量接種已培養(yǎng)18 h的種子于pH 7.0的生物發(fā)酵罐中，不同溫度（26、28、30、32、34、36、38℃）、650 r/min，培養(yǎng)18 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD560值1.173，隨著OD560值的增加，產(chǎn)量增加。溫度對(duì)酵母產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 溫度對(duì)酵母產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of the temperature on the result of yield

由圖2可知，由于本菌種具有耐高溫的特性，在適宜的溫度32℃以外，過(guò)高或過(guò)低的溫度對(duì)菌種的生長(zhǎng)量都有影響。當(dāng)溫度低于32℃時(shí)，菌種活性降低，新陳代謝活動(dòng)緩慢，呈休眠狀態(tài)，菌種的生長(zhǎng)量降低；當(dāng)溫度高于32℃時(shí)，菌種的對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期縮短，衰亡期更早出現(xiàn)，使菌種的生長(zhǎng)量降低。當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)，菌種停止生長(zhǎng)，甚至導(dǎo)致死亡，生長(zhǎng)速率隨溫度升高而迅速下降。因此，菌種最適生長(zhǎng)溫度為32℃。

2.3 pH對(duì)酵母產(chǎn)量的影響

pH對(duì)菌種生長(zhǎng)量的影響很大，不同微生物有不同的最適pH，對(duì)大多數(shù)菌種來(lái)說(shuō)，菌種有保持其體內(nèi)細(xì)胞酸質(zhì)度在接近中性條件下的能力，這樣有利于菌體進(jìn)行正常的新陳代謝。

按照接種量5.0%接種已培養(yǎng)18 h的種子于不同pH（2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）的生物發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，30℃、650 r/min搖床培養(yǎng)18 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD560值。pH對(duì)酵母產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH對(duì)酵母產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of the pH on the result of yield

由圖3可知，pH為4.0時(shí)，菌種數(shù)量很少，隨著pH的增加，菌種的數(shù)量逐步增加，在pH達(dá)到6.0時(shí)菌種數(shù)達(dá)到最高，OD560值為0.902，隨后，pH值越大，越抑制菌種的生長(zhǎng)，菌種數(shù)量開始逐漸下降。因此，菌種的最適pH為6.0。

2.4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)量的影響

按照接種量5.0%接種已培養(yǎng)18 h的種子于pH 7.0的生物發(fā)酵罐中，30℃、不同攪拌轉(zhuǎn)速（600、650、700、750、800、850、900 r/min）培養(yǎng)18 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD560值。攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖4。

圖4 攪拌轉(zhuǎn)速對(duì)酵母產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of the stir of revolution on the result of yield

由圖4可知，隨攪拌轉(zhuǎn)速的增加，對(duì)培養(yǎng)基的通氣量增加，菌體的生長(zhǎng)量也會(huì)隨著增加，在攪拌轉(zhuǎn)數(shù)為750 r/min至900 r/min生長(zhǎng)量較為接近。從生產(chǎn)成本考慮750 r/min為最適攪拌轉(zhuǎn)速。

2.5 接種量對(duì)產(chǎn)量的影響

按照不同接種量（1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%）接種已培養(yǎng)18 h的種子于pH 7.0的生物發(fā)酵罐培養(yǎng)基中，30℃、攪拌轉(zhuǎn)速650 r/min培養(yǎng)18 h，測(cè)定發(fā)酵液的OD560值。接種量對(duì)產(chǎn)量的影響見(jiàn)圖5。

圖5 接種量對(duì)產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of the inoculation size on the result of yield

由圖5可知，接種量以7.0%為宜。接種量過(guò)低時(shí)，菌種的數(shù)量也較低，對(duì)后期菌種的生長(zhǎng)量有不利的影響；接種量過(guò)大，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分消耗太快，有些初級(jí)代謝產(chǎn)物或次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生對(duì)菌種的生長(zhǎng)有抑制作用，曲線呈下降趨勢(shì)。因此菌種的最適接種量為7.0%。

2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了進(jìn)一步考察發(fā)酵條件對(duì)酵母產(chǎn)量的影響因素，進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

按照表1中數(shù)據(jù)進(jìn)行正交試驗(yàn)。通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出，極差R的大小順序?yàn)锳>B>D>C，即影響Y1359菌種生長(zhǎng)主次關(guān)系依次是浸提溫度>pH>接種量＞攪拌轉(zhuǎn)速。酵母生長(zhǎng)的最佳工藝條件為A3B1C3D1，即溫度34℃，pH 5.0，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min，接種量5%。在此條件下，Y1359OD560為1.315。

表1 因素水平表Table1 Factors and levels grap

表2 L9（34）正交試驗(yàn)表Table2 The L9（34）orthogonal test

表3 方差分析表Table3 The table of variance analysis

由表3方差分析結(jié)果可得出，溫度、pH、各組因素間重復(fù)性差異極顯著，接種量、搖床轉(zhuǎn)速也達(dá)到了顯著水平，說(shuō)明試驗(yàn)數(shù)據(jù)是可信的。方差分析顯示各因素對(duì)Y1359菌種生長(zhǎng)均有影響。

2.7 淀粉出酒率

將活化的耐高溫酒用酵母投入到液化、糖化的淀粉水解液中，經(jīng)過(guò)40℃恒溫發(fā)酵65 h，測(cè)的餾出液在20℃的酒精度為19.06%，出酒率為47%。

3 結(jié)論

在上述生長(zhǎng)條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果：最適溫度34℃，pH 5.0，攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min，接菌量5.0%，優(yōu)化后OD560為1.315。將活化的耐高溫酒用酵母投入到液化、糖化的淀粉水解液中，經(jīng)過(guò)40℃恒溫發(fā)酵65 h，測(cè)的餾出液在20℃的酒精度為19.06%，出酒率為47%。

[1]吳士業(yè),黃澤偉.酒用耐(嗜)酸酵母的誘變育種[J].中國(guó)釀造, 2010(8):124-126

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[8]錢存柔,黃儀秀.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教程[M].北京:北京大學(xué)出版社, 1999:36-55

Optimization of Fermentation Growth Condition Medium for Thermostability Wine Yeasts

WEI Chun-hong1，SHENG Yan2，WU Ze-zhu2
（1.College of Food，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing163319，Heilongjiang，China；2.Harbin Mauri Yeast Co.，Ltd.，Harbin 150300，Heilongjiang，China）

The growth condition for thermostability wine yeasts was investigated in this research.The results of single factor experiments showed that optimum growth temperature was 32℃，pH was 6.0，stir of revolution was 750 r/min，inoculation was 7.0%.Optimum growth temperature was 34℃，pH was 5.0，stir of revolution was 800 r/min，inoculation was 5.0%，optimization OD560value of 1.315.

thermostability；wine yeasts；growth condition

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.037

2016-03-14

魏春紅（1982—），女（漢），實(shí)驗(yàn)師，碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品精深加工。