周學(xué)亮，方義湖，趙 勇，鄒 斌，徐 華，劉季春

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科，江西南昌 330006)

大鼠Hes1腺病毒表達(dá)載體構(gòu)建及功能鑒定*

周學(xué)亮，方義湖#，趙 勇，鄒 斌，徐 華，劉季春△

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟大血管外科，江西南昌 330006)

目的 構(gòu)建高滴度大鼠Hes1腺病毒過表達(dá)載體(Ad-Hes1)。方法 以大鼠cDNA文庫為模板，PCR法擴(kuò)增Hes1，通過定向克隆構(gòu)建pShuttle-CMV-Hes1穿梭質(zhì)粒，再以pShuttle-CMV-Hes1為基礎(chǔ)，構(gòu)建pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒，將pAdeno-Hes1轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，包裝Ad-Hes1，利用改進(jìn)TCID50法進(jìn)行病毒滴度測定。Ad-Hes1感染H9c2心肌細(xì)胞，Western blot檢測Hes1表達(dá)。結(jié)果 pShuttle-CMV-Hes1穿梭質(zhì)粒、pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒構(gòu)建成功，總滴度為1.6×1011PFU，Ad-Hes1可在H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，其MOI值為30。結(jié)論 Ad-Hes1包裝成功，為進(jìn)一步研究Hes1的心肌保護(hù)作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

腺病毒科；肌細(xì)胞,心臟；Hes1；質(zhì)粒構(gòu)建；病毒包裝

Hes是果蠅hairy/E(spl)基因家族同系物，作為Notch1信號通路重要靶基因，其通過編碼抑制型堿性螺旋-環(huán)-螺旋 (basic Helix-Loop-Helix,bHLH)，在調(diào)節(jié)多種細(xì)胞分化、增殖的Notch信號途徑中起關(guān)鍵作用[1-3]，并影響細(xì)胞決定、發(fā)育、分化、增殖、凋亡、黏附及上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，Hes可與Stat3形成Hes1-Stat3復(fù)合物，促進(jìn)Stat3磷酸化和HIF-1α激活，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)作用[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，Hes1可作為介導(dǎo)分子，激活SAFE信號通路，發(fā)揮心肌作用[8]。因此本文將構(gòu)建包裝高滴度Hes1腺病毒病毒過表達(dá)載體(Ad-Hes1)，為進(jìn)一步探討Hes1心肌保護(hù)中的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及菌株 293細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫，DH5α超級化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞購自漢恒生物科技有限公司。

1.1.2 大鼠cDNA文庫及腺病毒載體系統(tǒng) 大鼠cDNA文庫購自TaKaRa公司；pShuttle-CMV重組穿梭質(zhì)粒、pAdeno質(zhì)粒購自漢恒生物科技有限公司。

1.1.3 主要試劑 限制性內(nèi)切酶(SfiⅠ,I-CeuⅠ,I-SceⅠ,XhoⅠ,PacⅠ)、Phusion超保真DNA聚合酶購自New England Biolabs公司，T4 DNA ligase購自Fermentas公司，CIP酶購自Promega公司，dNTPs購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，質(zhì)粒小/中量提取純化試劑盒、DNA純化試劑盒、DNA凝膠回收與純化試劑盒購自威格拉斯生物技術(shù)有限公司，LipofiterTM購自漢恒生物科技有限公司，細(xì)胞裂解液購自碧云天生物技術(shù)研究所，Mouse monoclonal to Hes1購自Abcam公司，β-Actin Mouse Monoclonal Antibody 購自Anbo公司，HRP affinipure goat anti-rabbit IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物購自Pierce Biotechnology公司。

1.1.4 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中的大鼠Hes1基因編碼序列(NCBI Reference Sequence:NM_024360.3)，Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Hes1克隆引物并插入SfiⅠ酶切位點(diǎn)(Forward Primer:5′-AAA AGG CCG CTG CGG CCA CCA TGA AGC GAC GAT GGA-3′,Reverse Primer:5′-AAA AGG CCT GTT TGG CCT CAG TTC CGC CAC GGC CT-3′)，產(chǎn)物大小為1 200 bp，由上海桑尼生物技術(shù)有限公司合成，規(guī)格為2A。

1.2 方法

1.2.1 pShuttle-CMV-Hes1重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 以大鼠cDNA文庫為模板，PCR法獲得Hes1片段，SfiⅠ酶切pShuttle-CMV重組穿梭載體及Hes1片段。CIP去磷酸化處理，T4 DNA Ligase連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，接種于含卡那霉素(Kan+)LB 平板培養(yǎng)皿。次日隨機(jī)挑選陽性單克隆菌落，于Kan+LB液態(tài)培養(yǎng)基搖菌過夜，隔日小提質(zhì)粒，行SfiⅠ酶切鑒定，再送上海桑尼生物技術(shù)有限公司基因測序。無突變的克隆命名為pShuttle-CMV-Hes1重組穿梭質(zhì)粒。

1.2.2 pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒構(gòu)建 I-CeuⅠ、I-SceⅠ雙酶切pAdeno載體、pShuttle-CMV-Hes1重組穿梭質(zhì)粒，CIP去磷酸化處理，T4 DNA Ligase連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，接種含氨芐西林(Amp+)LB平板培養(yǎng)皿。次日隨機(jī)挑選陽性單克隆菌落，于Amp+LB液態(tài)培養(yǎng)基搖菌過夜。隔日小提質(zhì)粒，行XhoⅠ酶切鑒定，再送上海桑尼生物技術(shù)有限公司基因測序，無突變的克隆命名為pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒。

1.2.3 Ad-Hes1包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測定 pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒PacI 限制性內(nèi)切酶線性化，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，6 h后更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，出毒完畢后收集所有細(xì)胞及培養(yǎng)液，于-80 ℃和37 ℃間凍融3次，3 000 r/min離心5 min，上清液即為Ad-Hes1第一代毒種(P1)，作為毒種-80 ℃保存。取P1代毒種感染293細(xì)胞，待所有細(xì)胞脫落底面開始收毒，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入1 mL ST buffer(培養(yǎng)液+10%血清+2.5%甘油)，Votex混勻，于-80 ℃和37 ℃間凍融3次，3 000 r/min離心5 min，取上清液(P2)-80 ℃保存。依前法利用P2代病毒大量擴(kuò)增病毒，純化后利用改良TCID50法行病毒滴度測定。

1.2.4 Ad-Hes1功能鑒定 H9c2細(xì)胞傳代107至6孔板，每孔分別加入約Ad-GFP、10 μL和30 μL(MOI約30和90)的Ad-Hes1腺病毒，4 h更換培養(yǎng)液，36 h后收集細(xì)胞蛋白，Western blot檢測Hes1表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 pShuttle-Hes1重組穿梭質(zhì)粒成功構(gòu)建 Hes1經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)SfiⅠ酶切插入pShuttle-CMV重組穿梭質(zhì)粒，獲得pShuttle-Hes1轉(zhuǎn)化子，SfiⅠ酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得1 200、3 400 bp兩條帶(圖1A)，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。DNAMAN(Version 6.0.3.99)比對分析基因測序結(jié)果，與大鼠Hes1基因編碼序列完全一致(圖1B)。

A:pShuttle-Hesl酶切鑒定；B:pShuttle-Hesl。

圖1 pShuttle-CMV-Hesl重組穿梭質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

2.2 pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒構(gòu)建 pShuttle-Hes1經(jīng)I-CeuⅠ、I-SceⅠ雙酶切，插入pAdeno載體獲得pAdeno-Hes1轉(zhuǎn)化子，XhoI酶切后行1%瓊脂糖凝膠電泳，獲得14.50、11.70、2.66、2.47、1.45、1.10、0.90、0.60 bp 8條帶(圖2)，與預(yù)計(jì)結(jié)果相符。

圖2 pAdeno-Hesl病毒質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 Ad-Hes1包裝、收毒、擴(kuò)增及滴度測定 pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，每天觀察細(xì)胞出毒跡象，出毒現(xiàn)象為細(xì)胞變大變圓，呈葡萄狀，并開始出現(xiàn)明顯噬斑，待細(xì)胞大部分病變并從底部脫落進(jìn)行收毒(圖3)。利用改進(jìn)TCID50法測定Ad-Hes1滴度，結(jié)果為1.6×1011PFU/mL，體積1 mL，總滴度為1.6×1011PFU。

A：出毒初期；Bp:出毒后期。

圖3 Ad-Hesl細(xì)胞出毒情況(×40)

2.4 Ad-Hes1功能鑒定 Ad-Hes1轉(zhuǎn)染H9c2心肌細(xì)胞，48 h后提總蛋白，Western blot顯示Hes1在Ad-Hes1組表達(dá)，病毒轉(zhuǎn)染量越大，表達(dá)量越大，提示Ad-Hes1構(gòu)建成功，可在H9c2細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)(圖4)。

圖4 Ad-Hesl在H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)

3 討 論

研究表明Hes基因家族包含Hes1-7，編碼bHLH發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期停滯、細(xì)胞凋亡及細(xì)胞自我更新等多個(gè)生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[5,9]。Hes1蛋白包含bHLH、orange、WRPW保守結(jié)構(gòu)域，bHLH包括與DNA結(jié)合的基本區(qū)域和螺旋-環(huán)-螺旋區(qū)域，其脯氨酸殘基使Hes與DNA相結(jié)合，促進(jìn)HLH形成二聚體。Orange為雙親性螺旋，位于bHLH結(jié)構(gòu)域下游，維持bHLH相互作用的特異性。WRPW位于肽鏈羧基端，與共抑制子TLE/Grg形成復(fù)合物后，再與DNA的N-盒結(jié)合，從而改變了染色體的結(jié)構(gòu)，使DNA的轉(zhuǎn)錄停止[10-11]。研究表明Hes1在心血管系統(tǒng)發(fā)揮重要作用，并發(fā)現(xiàn)Hes1在心臟前體細(xì)胞中表達(dá)，為心室流出道發(fā)育所必需[12]；筆者前期研究也表明心肌缺血后適應(yīng)可激活Hes1，從而提高細(xì)胞存活率，減少活性氧(ROS)形成，穩(wěn)定線粒體膜電位，抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放，最終抑制心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心肌保護(hù)作用[13]。為深入研究Hes1在心肌保護(hù)中的分子機(jī)制，利用基因異位表達(dá)技術(shù)，針對Hes1構(gòu)建病毒表達(dá)載體，可望在心肌細(xì)胞中特異性激活Hes1，從中觀察Hes1的心肌保護(hù)效應(yīng)。

目前，用于目的基因轉(zhuǎn)移的病毒載體主要包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體[14]。重組腺病毒載體系統(tǒng)是研究基因轉(zhuǎn)染最理想的載體系統(tǒng)，介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染效率高，適合用于絕大多數(shù)細(xì)胞和組織的轉(zhuǎn)基因表達(dá)研究；同時(shí)可以產(chǎn)生高滴度病毒，也可用于基因治療。重組腺病毒系統(tǒng)是E1和E3區(qū)缺陷的腺病毒載體系統(tǒng)，可重組高達(dá)10 000 bp的外源基因片段，免疫原性低，不引起宿主基因突變；并在同一載體上可克隆多個(gè)基因片段且能長效表達(dá)，產(chǎn)生的高滴度病毒既能感染分裂相細(xì)胞，又能感染未分裂相細(xì)胞，因此宿主范圍廣，應(yīng)用廣泛[15]。居于以上特點(diǎn)，考慮到由于Hes1片段較大，涉及細(xì)胞及動物實(shí)驗(yàn)，對病毒感染效率要求高，因此采用腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建Hes1過表達(dá)載體。

本研究應(yīng)用腺病毒載體系統(tǒng)先構(gòu)建pShuttle-CMV-Hes1重組穿梭質(zhì)粒，再以pShuttle-CMV-Hes1為骨架，構(gòu)建pAdeno-Hes1病毒質(zhì)粒，然后感染至293細(xì)胞中進(jìn)行病毒包裝，細(xì)胞出毒后收集第一代(P1)毒液，并以此為毒種進(jìn)行第二代(P2)出毒及大量病毒擴(kuò)增。病毒滴度測定后，再感染H9c2心肌細(xì)胞，以確定Ad-Hes1構(gòu)建成功，并可在心肌細(xì)胞里正常表達(dá)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)Notch1信號通路有明顯的心肌保護(hù)效應(yīng)[8]，Hes1作為Notch1信號的靶基因，是否在其中發(fā)揮重要作用需要進(jìn)一步研究論證，而Ad-Hes1的成功構(gòu)建，正為進(jìn)一步研究Hes1的心肌保護(hù)作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Construction and functional identification of rat Hes1 adenovirus expression vector*

ZhouXueliang,FangYihu#,ZhaoYong,ZouBin,XuHua,LiuJichun△

(DepartmentofCardiovascularSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofNanchangUniversity,Nanchang,Jiangxi330006,China)

Objective to construct the high titers rat Hes1 adenovirus expression vector (Ad-Hes1).Methods With the rat cDNA as a template,the Hes1 fragment was amplified by PCR,which constructed pShuttle-CMV-Hes1 shuttle plasmid by directly clone.Based on pShuttle-CMV-Hes1,pAdeno-Hes1 virus plasmid was constructed.pAdeno-Hes1 was transfected into 293 cells to package Ad-Hes1,virus titers were determined by modified TCID50.Hes1 was detected by Western blot after Ad-Hes1 infected with H9c2 myocardial cells.Results pShuttle-CMV-Hes1 shuttle plasmid and pAdeno-Hes1 plasmid were constructed successfully,with a general titer of 1.6×1011PFU,Ad-Hes1 can be expressed in H9c2 myocardial cells,and its MOI value was 30.Conclusion Ad-Hes1 is successfully constructed and packaged,thus provide basis for further research on the protection effect of Hes1 on myocardium.

adenoviridae;myocytes,cardiac;Hes1;plasmid construction;virus packaging

??·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.05.003

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81570262)；贛鄱555領(lǐng)軍人才計(jì)劃(贛組字[2013]58號)；江西省自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(20152ACB20026)。 作者簡介：周學(xué)亮(1980-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事心肌疾病的信號通路研究。#共同第一作者：方義湖(1971-)，教授，碩士，主要從事心血管疾病基礎(chǔ)研究?！?/p>

，E-mail:liujichun999@163.com。

R511.8

A

1671-8348(2017)05-0583-03

2016-07-18

2016-09-16)