付瓊++李文霞++殷金鳳+++潘敏

[摘要] 目的 探討土槿皮乙酸（PAB）對人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)作用及其相關(guān)機(jī)制。 方法 根據(jù)不同PAB濃度和作用時(shí)間，將Siha細(xì)胞分為對照組（0 μmol/L）及1、2、4、8、16 μmol/L PAB組和24、48、72 h組。采用CCK-8試劑盒檢測不同濃度（0、1、2、4、8、16 μmol/L）PAB作用不同時(shí)間（24、48、72 h）后對Siha細(xì)胞的增殖抑制率。采用免疫印跡法檢測不同濃度PAB（0、2、4、8 μmol/L）作用48 h后Siha細(xì)胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路及凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)變化。 結(jié)果 1、2、4、8、16 μmol/L PAB對Siha細(xì)胞增殖均有抑制作用，且呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系。與0 μmol/L PAB對照組比較，2、4、8 μmol/L PAB組Siha細(xì)胞PI3K、p-Akt、p-GSK-3β和抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加（P < 0.05）。 結(jié)論 PAB具有抗人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞作用，且可能與PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制及上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 土槿皮乙酸；宮頸癌；增殖；凋亡

[中圖分類號] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）11（a）-0029-04

Study on the inhibition effect of pseudolaric acid B in human cervical carcinoma cell line Siha and its mechanism

FU Qiong LI Wenxia YIN Jinfeng PAN Min

Department of Gynecology and Obstetrics， Chengdu Second People's Hospital， Sichuan Province， Chengdu 610017， China

[Abstract] Objective To explore the effect of pseudolaric acid B （PAB） on human cervical carcinoma cell line Siha and its mechanism. Methods Siha cells were divided into control group （0 μmol/L PAB） and 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L PAB group according to the concentrations of PAB， and 24， 48， 72 h group according to the treating time of PAB. The inhibitory effect of different concentrations of PAB （0， 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L） and different exposure time （24， 48， 72 h） on Siha cells were measured by CCK-8 essay. The protein expression levels of PI3K， Akt， p-Akt， GSK-3β， p-GSK-3β， Bax and Bcl-2 were detected by immunoblotting. Results 1， 2， 4， 8， 16 μmol/L PAB had remarkable inhibiting effects on Siha cells and in a dose- and time-dependent manner. The protein expression levels of PI3K， p-Akt， p-GSK-3β and Bcl-2 were decreased in 2， 4， 8 μmol/L group of Siha cells than 0 μmol/L group after 48 exposure （all P < 0.05）. On the contrary， the protein expression level of Bax was increased （P < 0.05）. Conclusion PAB can inhibit the proliferation of Siha cells， its mechanism may be related to the inhibition of PI3K/Akt/GSK-3β signaling pathway and the up-regulation of Bax and down-regulation of Bcl-2.

土槿皮為松科植物金錢松的干燥根皮或近根樹皮，土槿皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）是從土槿皮中提取分離得到的新型二萜酸化合物。有研究表明PAB具有抗真菌[1]、抗腫瘤[2-5]、抗血管生成[6-7]、激活過氧化物酶體增生物激活受體[8]等藥理作用。宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家尤為常見，是婦科三大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅婦女的健康[9]。因此，研究藥物對人宮頸癌細(xì)胞作用的分子機(jī)制，對宮頸癌的治療和預(yù)防具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

PAB購于成都瑞芬思生物科技公司（規(guī)格：500 mg，批號：20160412）；RPMI1640培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）購于上海吉諾生物科技公司；胎牛血清購于杭州四季青生物公司（批號：160413）；CCK-8試劑盒（批號：20160318）、BCA試劑盒（批號：20160317）購于武漢科瑞生物科技公司；RAPI裂解液（批號：20160317）、抗β-actin（貨號：GB13001-3）一抗購于武漢谷歌生物公司；抗PI3K（貨號：4257）、Akt（貨號：9272）、p-Akt（貨號：4060）、GSK-3β（貨號：9315）、p-GSK-3β（貨號：9322）、Bax（貨號：5023）和Bcl-2（貨號：3498）一抗購于美國CST公司；羊抗兔熒光二抗（貨號：C40109-04）購于美國LI-COR公司。CO2培養(yǎng)箱為德國BINDER公司產(chǎn)品（BD53型）；倒置顯微鏡為日本OLYMPUS公司產(chǎn)品（CKX31型）；酶標(biāo)儀為美國PerkinElmer公司產(chǎn)品（1420型）；電泳電轉(zhuǎn)儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品（DYCZ-40D型）；雙色紅外激光成像系統(tǒng)為美國LI-COR公司產(chǎn)品（Odyssey）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人宮頸鱗癌Siha細(xì)胞購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測 Siha細(xì)胞以5×103/孔種于96孔板，24 h后更換含不同濃度PAB的培養(yǎng)基100 μL。藥物濃度分別為0、1、2、4、8、16 μmol/L，每個濃度設(shè)6個副孔，分別于24、48、72 h更換CCK-8檢測試劑100 μL（90 μL RMPI1640培養(yǎng)基+10 μL CCK-8液），于5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長檢測各孔的吸光度值（A）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率：抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組平均A值/對照組平均A值）×100%。

1.2.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn) A2780細(xì)胞以2×105/孔種于6孔板，24 h后更換含不同濃度PAB的培養(yǎng)基1.5 mL，藥物濃度分別為0（對照組）、2、4、8 μmol/L，48 h后吸出培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS洗1遍，向每孔細(xì)胞中加入預(yù)冷的RIPA裂解液（含1%苯甲基磺酰氟）200 μL，冰上靜置5 min后用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞轉(zhuǎn)入無菌EP管中，冰上裂解30 min。12 000g低溫離心5 min，取上清，每個樣本取20 μL上清用BCA法測定蛋白樣品濃度，剩余蛋白上清加入上樣緩沖液充分混勻后100℃水浴加熱10 min。每孔20 μg蛋白體系，行10% SDS-PAGE凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜；3%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（PI3K 1∶1000、Akt 1∶1000、p-Akt 1∶2000、GSK-3β 1∶1000、p-GSK-3β 1∶1000、Bax 1∶1000、Bcl-2 1∶1000、β-actin 1∶2000）4℃搖床孵育過夜；洗膜后加入熒光山羊抗兔二抗（1∶10 000）室溫?fù)u床孵育1 h，洗膜后于雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃描收集熒光信號。以β-actin為內(nèi)參照，采用QuantityOne-v4.6.2軟件對Western條帶進(jìn)行定量分析，蛋白條帶與內(nèi)參的灰度比值為相對表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，各實(shí)驗(yàn)組與對照組間的兩兩比較采用Dunnett法，實(shí)驗(yàn)組之間的兩兩比較采用SNK法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度PAB作用不同時(shí)間后對Siha細(xì)胞增殖抑制率的影響

與對照組比較，1、2、4、8、16 μmol/L PAB處理Siha細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，且與藥物作用時(shí)間和藥物濃度呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 PAB對Siha細(xì)胞PI3K/Akt/GSK-3β信號通路的影響

與對照組比較，2、4、8 μmol/LPAB作用48 h后，PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達(dá)減少（P < 0.05），而Akt和GSK-3β蛋白表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。此外，與2 μmol/L組比較，4 μmol/L組細(xì)胞PI3K和p-GSK3β蛋白表達(dá)降低（P < 0.05），同時(shí)，與4 μmol/L組比較，8 μmol/L組細(xì)胞PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達(dá)下調(diào)（P < 0.05）。因此，PAB能下調(diào)PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。見圖1。

2.3 PAB對Siha細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

與對照組比較，2、4、8 μmol/LPAB處理組細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加（P < 0.05），而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)（P < 0.05）。此外，與4 μmol/L組比較，8 μmol/L組細(xì)胞Bax蛋白表達(dá)減少，且4 μmol/L組和8 μmol/L組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)分別較2 μmol/L組和4 μmol/L組減少（P < 0.05）。因此PAB可上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。見圖2。

3 討論

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的半數(shù)以上，嚴(yán)重威脅女性的健康[10]。PAB是從土槿皮中提取分離得到的新型二萜酸化合物。研究表明PAB對于多種腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的抑制作用[2-5]。本實(shí)驗(yàn)用PAB體外實(shí)驗(yàn)研究觀察該藥對Siha細(xì)胞的抑制作用。結(jié)果表明，PAB在1～16 μmol/L濃度范圍內(nèi)對Siha細(xì)胞的增殖均有抑制作用，并呈現(xiàn)明顯的劑量和時(shí)間依賴效應(yīng)關(guān)系，表明該藥對宮頸癌有治療潛能。

研究表明，磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（phosphoinositide-3-kinese/protein kinase B，PI3K/Akt）通路與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、治療耐藥性密切相關(guān)[11]，細(xì)胞在一系列內(nèi)外因素的作用下，通過PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖、分化，避免細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。GSK3是一種可以調(diào)控多種細(xì)胞功能的關(guān)鍵酶[13]，是調(diào)節(jié)糖原合成的關(guān)鍵激酶，磷酸化糖原合酶并使之失活，從而抑制糖原合成促進(jìn)糖代謝[14]，同時(shí)參與到多種信號通路的調(diào)節(jié)[14-16]。研究[17-18]表明GSK3的激活在多種情況下參與到細(xì)胞凋亡過程。Saiprasad等[19]研究表明GSK-3β參與到PI3K/AKT介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程。本研究為了研究PI3K/AKT/GSK-3β在PAB誘導(dǎo)宮頸癌Siha細(xì)胞凋亡中的作用，采用不同濃度的PAB處理Siha細(xì)胞，結(jié)果表明，在2、4、8 μmol/LPAB作用48 h后，PI3K、p-Akt和p-GSK-3β蛋白表達(dá)明顯減少，而Akt和GSK-3β蛋白表達(dá)無變化，說明PAB可抑制Siha細(xì)胞PI3K/AKT/GSK-3β信號通路。

Bcl-2家族成員在腫瘤細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮重要作用[20]。Bax活化后引起細(xì)胞色素C釋放到胞漿中并與apaf-1結(jié)合激活Caspase-9，然后激活下游的Caspase-3等。在不同濃度PAB對誘導(dǎo)的Siha細(xì)胞凋亡中，本研究發(fā)現(xiàn)2、4、8 μmol/LPAB處理組Siha細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)明顯增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下調(diào)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，表明PAB通過增加Bax/Bcl-2的比例，激活以線粒體為中心的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

綜上所述，PAB為一種具有潛在抗人宮頸癌作用的中藥活性成分，可通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路來抑制細(xì)胞的增殖，并通過促進(jìn)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，為臨床應(yīng)用PAB治療宮頸癌提供了有力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)和理論依據(jù)，為新藥的研發(fā)開辟了新領(lǐng)域。

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（收稿日期：2016-08-04 本文編輯：張瑜杰）