姚雪倩，岳川，楊國(guó)一，陳丹，張冬桃，陳桂信，葉乃興

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茶樹(shù)牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶基因的克隆及表達(dá)分析

姚雪倩，岳川，楊國(guó)一，陳丹，張冬桃，陳桂信*，葉乃興*

福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院中國(guó)烏龍茶協(xié)同創(chuàng)新中心，福建福州 350002

以鐵觀音芽葉為材料，驗(yàn)證從茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選到的1條牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（GGDPS）的編碼全長(zhǎng)序列cDNA。該cDNA全長(zhǎng)1?661?bp，含有1個(gè)1?137?bp完整的開(kāi)放閱讀框，命名為。該基因編碼378個(gè)氨基酸，氨基酸序列具有類異戊二烯合成酶家族的5個(gè)保守域和2個(gè)特征功能域；序列分析顯示，該cDNA與其他植物GGDPS高度保守，與三七（）的親緣關(guān)系最近。CsGGDPS屬于不穩(wěn)定、親水蛋白，可能定位到葉綠體中，不存在跨膜結(jié)構(gòu)，無(wú)信號(hào)肽，發(fā)生磷酸化的位點(diǎn)可能有20個(gè)；二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，三級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥GGPPS11匹配度最高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，在茶樹(shù)發(fā)育過(guò)程和不同葉位的表達(dá)量隨芽葉成熟度的增加呈上升趨勢(shì)，隨著做青過(guò)程的進(jìn)行，的表達(dá)量逐漸升高；在父本黃旦、母本鐵觀音和子一代金觀音中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異。

茶樹(shù)；牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶；茶葉香氣；基因表達(dá)

茶樹(shù)（(L.) O. Kuntze）是多年生常綠木本植物。茶樹(shù)品種、茶園生態(tài)及茶葉加工工藝等是影響茶葉香氣的重要因素。萜烯類化合物作為茶葉香氣的重要組分之一，其含量占春季茶鮮葉總揮發(fā)油的51.26%，主要包含芳樟醇、香葉醇、橙花叔醇、法尼烯、萜品烯、杜松烯等物質(zhì)[1-2]。植物中萜烯類化合物合成途徑復(fù)雜，由多種酶參與其合成調(diào)控。其中，牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl diphosphate synthase, GGDPS），是植物萜類物質(zhì)合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[3-4]。植物萜類化合物合成途徑的第一階段經(jīng)甲羥戊酸途徑（Mevalonic acid, MVA）和甲基赤鮮糖醇磷酸途徑（Methyl- erythritol-phosph-ate, MEP）生成的終產(chǎn)物——異戊烯基焦磷酸（Isopenteny pyrophosphate, IPP）和其雙鍵異構(gòu)體二甲烯丙基焦磷酸酯（Dimethylallyl diphosphate, DMAPP），是合成牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（Geranylgeranyl diphosphate, GGDP）的關(guān)鍵底物。第二階段中，GGDPS能夠以3分子IPP與1分子DMAPP、1分子IPP和1分子法尼基焦磷酸（Famesyl pyrophosphate, FPP）或者2分子IPP和1分子牻牛兒基焦磷酸（Geranyl diphosphate, GPP）為底物，分別催化縮合生成GGDP[5-6]。GGDP是一種類異戊二烯化合物，該通用前體物在多步不同酶促反應(yīng)下參與葉綠素、類胡蘿卜素、赤霉素、脫落酸、獨(dú)腳金內(nèi)酯、輔酶Q、維生素K、維生素E、多酚和多萜醇等的生物合成，同時(shí)還能調(diào)控植物代謝中“碳流”的方向和催化蛋白的異戊二烯化等[7-10]。因此，GGDPS被認(rèn)為是植物體內(nèi)合成二萜、四萜和多萜類化合物等重要初級(jí)和次級(jí)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和防御中扮演重要角色。盡管茶樹(shù)中萜烯類合成途徑中的多種關(guān)鍵酶基因已有報(bào)道，如乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶（Acetyl-CoA C-acetyltransferase, AACT）[11]、l-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶（1-deoxy- D- xylulose-5- phosphate reductoisomerase, DXR）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3- methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR）[12]等，但GGDPS基因及其在茶葉香氣形成中的作用未見(jiàn)報(bào)道。

本研究以茶樹(shù)芽葉為材料，克隆并驗(yàn)證從茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中篩選到的全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)該基因的生物信息學(xué)特征進(jìn)行了全面的分析；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究該基因在鐵觀音茶樹(shù)芽葉發(fā)育過(guò)程、不同葉位，以及做青過(guò)程不同階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式，并分析了該基因在父母本和子一代間的表達(dá)量變化，為揭示烏龍茶萜烯類香氣形成的分子機(jī)制和香氣相關(guān)基因在茶樹(shù)親子代間的差異表達(dá)模式提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試材料：2016年3月中旬至5月中旬于福建農(nóng)林大學(xué)南區(qū)教學(xué)茶場(chǎng)采集以下4種樣品：（1）從3月中旬開(kāi)始，對(duì)鐵觀音茶樹(shù)進(jìn)行掛牌，每隔1?d對(duì)鐵觀音春梢芽葉發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察，摘取各生育期長(zhǎng)勢(shì)一致的芽頭、第一葉、第二葉、第三葉和第四葉，用于研究在茶樹(shù)芽葉發(fā)育過(guò)程不同階段的表達(dá)模式變化；（2）以鐵觀音（母本）、黃旦（父本）和金觀音（雜交子一代）品種的一芽二葉為供試材料，用于研究在父母本和子一代中的表達(dá)量變化；（3）采摘鐵觀音春梢中小開(kāi)面時(shí)期的第一葉、第二葉、第三葉和第四葉，研究在不同葉位的表達(dá)模式；（4）以鐵觀音中小開(kāi)面二三葉為鮮葉原料，按閩南烏龍茶做青工藝進(jìn)行做青[13]，并對(duì)鮮葉、曬青葉以及一搖后、二搖后、三搖后、殺青前各階段進(jìn)行取樣。采集的樣品用錫箔紙包裹并標(biāo)記，液氮速凍后移入—80℃冰箱保存?zhèn)溆茫總€(gè)樣品3次重復(fù)。

試劑：RNAprep Pure Plant Kit（Polysaccharides & Polyphenolics-rich）和Universal DNA Purification Kit購(gòu)自天根生化科技有限公司；SuperScriptTMII Reverse Transcriptase購(gòu)自Invitrogen公司；KlenTaq LA Polymerase Mix和DL2000 DNA Marker購(gòu)自Clontech公司；DNA Polymerase High Fidelity (HiFi)、-T1 Simple Cloning Kit和-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell、One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix購(gòu)自北京全式金公司；2×PCR StarMix with Loading Dye購(gòu)自普洛斯生物科技有限公司；瓊脂糖Agarose為西班牙進(jìn)口試劑；50×TAE電泳緩沖液和DEPC處理水購(gòu)自北京索萊寶公司；引物合成和測(cè)序由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供試材料總RNA的提取

取適量供試樣品，液氮研磨后，按照天根植物多糖多酚提取試劑盒的操作步驟提取茶樹(shù)總RNA。提取的總RNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，合格的RNA樣品于—80℃保存。

1.2.2 cDNA的合成

以鐵觀音一芽二葉為材料，以提取的總RNA為模板，參照SMARTTMcDNA Library Construction Kit說(shuō)明書(shū)，采用SMART兩步逆轉(zhuǎn)錄法合成cDNA第一鏈，采用抑制LA-PCR合成cDNA第二鏈，即制備好普通RT-PCR模板。按照全式金的One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒方法合成的cDNA作為熒光定量PCR的模板。

1.2.3的全長(zhǎng)驗(yàn)證

在茶樹(shù)高通量全轉(zhuǎn)錄組（SRX1676258）數(shù)據(jù)庫(kù)中找到1個(gè)GGDPS基因全長(zhǎng)序列，利用該序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)引物-fl-F、-fl-R（表1），以鐵觀音一芽二葉總RNA的反轉(zhuǎn)錄第二鏈cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：10×HiFi Buffer Ⅱ2.5?μL，2.5?mmol·L-1dNTPs 2?μL，-fl-F和-fl-R（10?μmol·L-1）各0.5?μL，HiFi Polymerase 0.125?μL，Template DNA 1?μL，DEPC處理水補(bǔ)至25?μL。程序：95℃預(yù)變性5?min，95℃變性30?s，55℃退火90?s，72℃延伸2?min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10?min，最后保持4℃。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在紫外燈下切割目的片段大小的條帶，并用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。新鮮PCR產(chǎn)物與-T1載體連接，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入-T1化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。通過(guò)藍(lán)白斑篩選與菌落PCR鑒定得到陽(yáng)性克隆，挑選3個(gè)陽(yáng)性菌液送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 CsGGDPS的生物信息學(xué)特征分析

對(duì)所得全長(zhǎng)cDNA序列，利用NCBI網(wǎng)站在線查找ORF和同源性檢索等；利用protparam、protscale、TMHMM-2.0、NetPhos、SignalP、TargetP軟件分別對(duì)保守區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行理化性質(zhì)、親疏水性、跨膜結(jié)構(gòu)、磷酸化位點(diǎn)、信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析和亞細(xì)胞定位；利用predictprotein和swissmodel兩個(gè)軟件預(yù)測(cè)分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)；利用DNAMAN軟件進(jìn)行CsGGDPS氨基酸多序列比對(duì)；利用MEGA5.0軟件構(gòu)建茶樹(shù)GGDPS與其他物種GGDPS的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 CsGGDPS實(shí)時(shí)熒光定量PCR表達(dá)分析

根據(jù)全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物-QPCR-F、-QPCR-R（表1）。以茶樹(shù)為內(nèi)參基因，檢測(cè)在鐵觀音芽葉發(fā)育過(guò)程、不同葉位、做青過(guò)程，以及親本與子代間的相對(duì)表達(dá)量變化。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2003和2–ΔΔT法進(jìn)行定量分析。

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹(shù)CsGGDPS全長(zhǎng)cDNA序列的驗(yàn)證及序列分析

從茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中獲得的1?597?bp的序列，NCBI BLASTx比對(duì)顯示它具有完整的開(kāi)放閱讀框（ORF）。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增驗(yàn)證其全長(zhǎng)ORF，PCR結(jié)果顯示擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期目的片段大小基本一致，約1?500?bp（圖1）。測(cè)序結(jié)果拼接后，獲得全長(zhǎng)序列。BLASTn分析表明，它與公布的茶樹(shù)基因（登錄號(hào)：KU892076）的同源性達(dá)到99%。在鐵觀音中擴(kuò)增出GGDPS基因，命名為。該序列全長(zhǎng)1?661?bp，含有200?bp 5′非編碼區(qū)（UTR）、1?137?bp ORF（201~1?337?bp），324?bp 3′非編碼區(qū)（UTR）。

圖1 鐵觀音CsGGDPS擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.2 茶樹(shù)CsGGDPS的生物信息學(xué)分析

2.2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

在線軟件預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為41.12?kDa，理論等電點(diǎn)為6.37，由378個(gè)氨基酸組成，半衰期為30?h。該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為41.26，整個(gè)多肽鏈中分值最低（－3.333）的氨基酸親水性最強(qiáng)；分值最高（2.433）的氨基酸疏水性最強(qiáng)（圖2），總平均親水性為－0.072，推測(cè)該蛋白為不穩(wěn)定、親水性蛋白。

圖2 CsGGDPS蛋白親/疏水性分析

2.2.2 跨膜結(jié)構(gòu)、信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

跨膜區(qū)域顯示（圖3）整條肽鏈位于膜外，故CsGGDPS不存在跨膜結(jié)構(gòu)，非膜蛋白，可能是在游離核糖體上合成蛋白多肽。TargetP1.1 Server在線分析含有信號(hào)肽（Signal peptide, SP）的可能性分值為0.007，說(shuō)明CsGGDPS不具有信號(hào)肽，屬于非分泌蛋白，該結(jié)果與SignalP-HMM預(yù)測(cè)結(jié)果一致。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示，全氨基酸序列中葉綠體運(yùn)輸肽（Chloroplast transit peptide, cTP）的可能性分值最高為0.764，線粒體靶向肽（Mitochondrial targeting peptide, mTP）的可能性分值為0.247，其他可能性分值為0.051，可靠等級(jí)值為3，由此推斷CsGGDPS蛋白定位到葉綠體上。在細(xì)胞質(zhì)中合成GGDPS，再在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的協(xié)助下進(jìn)入葉綠體，于葉綠體基質(zhì)中與底物結(jié)合催化合成GGDP。

圖3 CsGGDPS蛋白跨膜區(qū)域分析

2.2.3 CsGGDPS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

CsGGDPS蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋構(gòu)成，占47.62%，其次為不規(guī)則卷曲，占30.42%，N端含有較多不規(guī)則卷曲，可能存在活性位點(diǎn)，延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角同樣分布于整個(gè)肽鏈中，分別占15.08%和6.88%。CsGGDPS的三級(jí)結(jié)構(gòu)建模與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)類似（圖4），預(yù)測(cè)結(jié)果評(píng)估顯示GMQE分值為0.71，說(shuō)明構(gòu)建的CsGGDPS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)可信度高。建模結(jié)果顯示，CsGGDPS為同源二聚體蛋白，與擬南芥的GGPPS11（5e8l.1.B）匹配度最高（79.39%），因此借助模式植物擬南芥該基因的表達(dá)情況可為深入研究奠定基礎(chǔ)。

圖4 CsGGDPS蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.2.4 磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

通過(guò)NetPhos 2.0 Serve對(duì)CsGGDPS進(jìn)行磷酸化結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，絲氨酸的磷酸化位點(diǎn)可能有14個(gè)，位于多肽鏈的第23、25、60、97、107、215、216、229、244、249、282、313、340、356位氨基酸，其中第107、215、216、313、356位氨基酸的預(yù)測(cè)值均達(dá)到0.980以上，說(shuō)明這些位點(diǎn)的絲氨酸發(fā)生磷酸化的可能性較高。蘇氨酸可能的磷酸化位點(diǎn)有6個(gè)，分別為第26、48、66、76、211、264位氨基酸。

2.2.5 同源性比對(duì)和分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

將CsGGDPS的氨基酸序列進(jìn)行BLASTp比對(duì)，結(jié)果顯示（圖5），該氨基酸序列屬于類異戊二烯家族，含有底物結(jié)合袋（Substrate binding pocket）、底物-Mg2+結(jié)合位點(diǎn)（Substrate-Mg2+binding site）、鏈長(zhǎng)決定區(qū)（Chain length determination region）、催化殘基的活性位點(diǎn)，以及3個(gè)特異結(jié)構(gòu)域“Trans_ IPPS_HT”、“IspA”和“Polypreny_synt”等。CsGGDPS與多個(gè)物種中的GGDPS具有較高的相似性，相似性均在70%以上，其中與三七（）、長(zhǎng)春花（）、芝麻（）、米團(tuán)花（）、葡萄（）的相似度分別為77%、75%、74%、73%、71%；將它與8個(gè)物種GGDPS氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)合功能結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示（圖6），這些植物的GGDPS基因都包含聚異戊二烯合成酶的5個(gè)特征性功能結(jié)構(gòu)域（ⅠⅤ），同時(shí)含有2個(gè)幾乎所有萜類合成酶共有的保守區(qū)天冬氨酸富集基序DDXXXXD和DDXXD（X可為任意氨基酸）。CsGGDPS在5′端前86個(gè)氨基酸位點(diǎn)保守性較低，從第87位開(kāi)始到之后的位點(diǎn)氨基酸保守性較高。

將19個(gè)物種的GGDPS氨基酸序列采用鄰近連接法（Neighbor-Joining, NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖7）。GGDPS在分子進(jìn)化樹(shù)上被分為兩大類，其中CsGGDPS與三七（）的聚在一起，親緣關(guān)系最近，同時(shí)與長(zhǎng)春花（）和龍膽（）的親緣關(guān)系也較近；而與木本植物，如蘋(píng)果、白梨、胡楊等的關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.3 CsGGDPS相對(duì)熒光定量PCR表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)在鐵觀音芽葉發(fā)育過(guò)程不同階段、不同葉位和做青過(guò)程的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示，在發(fā)育過(guò)程中，的表達(dá)量總體呈上升趨勢(shì)，以芽頭為對(duì)照，一葉時(shí)表達(dá)量約為芽頭的2倍，從二葉到四葉過(guò)程中，的表達(dá)量呈明顯上升趨勢(shì)，四葉期的表達(dá)量最高，約為芽頭的4倍（圖8-A）。在不同葉位中，從第一葉到第四葉，的表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，其中第三葉的表達(dá)量達(dá)到最高，約為第一葉的2倍，第四葉中仍保持較高的表達(dá)量水平（圖8-B）。在做青過(guò)程中，從鮮葉到曬青葉，的表達(dá)量較低且增長(zhǎng)緩慢；一搖后表達(dá)量增加，與鮮葉相比，二者相差近6倍；隨著做青過(guò)程的進(jìn)行，從二搖后到殺青前，的表達(dá)量顯著升高，殺青前的表達(dá)量達(dá)到最高，約為鮮葉的20倍（圖8-C）。

研究檢測(cè)了在鐵觀音母本（♀）、黃旦父本（♂）及它們的雜交子一代金觀音3個(gè)品種間的表達(dá)水平。結(jié)果顯示（圖9），在親本黃旦、鐵觀音和子一代金觀音中均有表達(dá)，屬于基因差異表達(dá)模式中的共同表達(dá)型。然而，在鐵觀音中的表達(dá)量顯著高于黃旦，它們的雜交后代金觀音中的表達(dá)水平介于父母本之間，呈現(xiàn)偏低親的雜種表達(dá)量現(xiàn)象，這可能與3個(gè)品種間香氣差異有關(guān)。

圖9 茶樹(shù)親本與子一代間CsGGDPS表達(dá)分析

3 討論

茶樹(shù)中芳香物質(zhì)代謝包括不飽和脂肪族醇、芳香族醇和萜烯類化合物3個(gè)方面的生物合成與轉(zhuǎn)化[14]。本研究克隆了鐵觀音中CsGGDPS基因，該基因編碼蛋白是植物萜烯類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶之一。CsGGDPS基因cDNA全長(zhǎng)1?661?bp，與其他植物的具有較高的相似性，氨基酸多重序列比對(duì)顯示該序列含5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域以及GGDPS的特異功能域——FARM（the first aspartate-rich motif）和SARM（the second aspartate-rich motif），這2個(gè)基序是GGDPS關(guān)鍵的催化活性位點(diǎn)，對(duì)Mg2+橋與底物分子二磷酸基團(tuán)的結(jié)合至關(guān)重要[15-16]。

本研究結(jié)果表明，在鐵觀音芽葉發(fā)育過(guò)程和不同葉位的相對(duì)表達(dá)量總體隨芽葉成熟度的增加而呈上升的趨勢(shì)，與劉晶晶等[17]研究萜類化合物在茶樹(shù)發(fā)育階段的合成與釋放大體表現(xiàn)為幼葉中多、老葉中少的結(jié)果一致。張冬桃[18]分析了萜類代謝途徑的關(guān)鍵基因，如等在鐵觀音發(fā)育過(guò)程和不同葉位的表達(dá)量情況，結(jié)果表明這些基因的表達(dá)均隨芽葉成熟進(jìn)程呈上升趨勢(shì)。從CsGGDPS的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)可以看出，它與三七聚為一類。閔丹丹[4]研究發(fā)現(xiàn)，三七可能與三七葉綠素、類胡蘿卜素等二萜物質(zhì)的合成代謝及葉綠體的發(fā)育有關(guān)，由此可推測(cè)可能與三七的功能相近，伴隨芽葉成熟度的增加，茶樹(shù)體內(nèi)不斷合成葉綠素和類胡蘿卜素等供茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育必需的物質(zhì)，萜類前體物質(zhì)也逐步積累[19]，最終導(dǎo)致定位于葉綠體中的萜類合成酶的表達(dá)量上升。這與烏龍茶生產(chǎn)加工需采摘一定成熟度芽葉的理論相吻合。雖然前人有研究表明，未受損傷的茶樹(shù)鮮葉基本無(wú)味或味輕微[20]，但以中小開(kāi)面為標(biāo)準(zhǔn)采摘的烏龍茶鮮葉中能檢測(cè)到更多微量的游離態(tài)萜類香氣物質(zhì)，為烏龍茶制茶過(guò)程中香氣品質(zhì)的形成與轉(zhuǎn)化提供物質(zhì)基礎(chǔ)。做青是烏龍茶獨(dú)特香氣形成的關(guān)鍵工序，其中的搖青工序使茶鮮葉破損，細(xì)胞組織機(jī)械損傷，加速萜烯糖苷的水解。β-葡萄糖苷酶在水解萜烯類香氣前驅(qū)體中發(fā)揮重要作用[21]。張秀云等[22]研究發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷酶在做青過(guò)程中呈峰型變化，做青結(jié)束前2?h活性達(dá)到最高，糖苷鍵合態(tài)香氣物質(zhì)水解為游離態(tài)的能力最強(qiáng)，促使己烯酯類、芳樟醇氧化物、倍半萜烯類、順-茉莉酮、茉莉內(nèi)酯和苯乙醛等芳香物質(zhì)大量形成[23]。做青過(guò)程中茶鮮葉內(nèi)部氧氣、水分、膜透性發(fā)生變化，搖青使脂肪酸氧化裂解生成的青葉醇和青葉醛大部分揮發(fā)，留下少量具有清香的反式青葉醇[24]。烏龍茶做青過(guò)程中還伴隨胡蘿卜素類的氧化降解產(chǎn)物生成，如β-紫羅酮、二氫?？麅?nèi)酯、茶螺烯酮等香氣物質(zhì)[25]。烏龍茶品質(zhì)特征主要形成于三搖或其后階段，橙花叔醇、香葉醇、芳樟醇及其氧化物、吲哚、α-法尼烯、順-茉莉酮等香氣組分在一定搖青強(qiáng)度范圍內(nèi)不斷積累[26-29]。本研究發(fā)現(xiàn)，在鐵觀音做青過(guò)程中表達(dá)量顯著增加，殺青前其表達(dá)量最高可達(dá)到鮮葉的20倍。由前面的研究結(jié)果分析，3次搖青靜置后的做青葉，具有典型的蘭花香，對(duì)烏龍茶品質(zhì)具有重要的影響。因此，由在鐵觀音芽葉發(fā)育過(guò)程、不同葉位和做青過(guò)程的表達(dá)結(jié)果推測(cè)，該基因與烏龍茶萜烯類香氣品質(zhì)的形成密切相關(guān)。

在母本鐵觀音、父本黃旦和子一代金觀音中的表達(dá)差異較大。金觀音中的表達(dá)量接近父本而顯著低于母本，屬于基因表達(dá)量差異中的偏低親表達(dá)模式，也稱作非加性表達(dá)[30]。這與Li等[31]提出的關(guān)于雙親中不同表達(dá)量的基因比相同表達(dá)量的基因更易呈現(xiàn)非加性表達(dá)模式的觀點(diǎn)相近，如苜蓿中這一比值為3∶1。郭吉春等[32]對(duì)金觀音的選育研究認(rèn)為，金觀音的遺傳性狀趨向母本，該觀點(diǎn)與本實(shí)驗(yàn)在金觀音和鐵觀音中表達(dá)量有明顯差異的結(jié)果不一致。因此推測(cè)，雙親和子一代中表達(dá)的差異既有可能受順式作用元件、反式作用元件或二者共同作用的影響，也有可能與它們的基因表達(dá)調(diào)控、表觀遺傳機(jī)制有關(guān)。鐵觀音和黃旦作為重要的烏龍茶育種材料，通過(guò)雜交選育了一批優(yōu)良的茶樹(shù)品種，豐富了烏龍茶品種資源，對(duì)烏龍茶的發(fā)展產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。但由于茶樹(shù)是異花授粉的遺傳雜合體，親本與F1代間在一定程度上存在遺傳差異[33]，所以鐵觀音和黃旦雜交后基因的遺傳規(guī)律還有待后續(xù)研究。茶葉香氣這一品質(zhì)性狀屬于數(shù)量性狀，數(shù)量性狀從微效多基因控制過(guò)渡到主基因-多基因混合控制形成植物雜種優(yōu)勢(shì)[34]。因此，萜類合成酶相關(guān)基因在雜種和親本中的遺傳趨勢(shì)有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證，以期為雜種的早期選擇、雜種優(yōu)勢(shì)形成理論和烏龍茶加工過(guò)程中萜烯類香氣形成等的解析提供理論依據(jù)。

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Cloning and Expression Analysis of Geranylgeranyl Diphosphate Synthase Genein Tea Plant ()

YAO Xueqian, YUE Chuan, YANG Guoyi, CHEN Dan, ZHANG Dongtao, CHEN Guixin*, YE Naixing*

College of Horticulture, Fujian Agriculture and Forestry University, Collaborative Innovation Center of Chinese Oolong Tea Industry, Fuzhou 350002, China

A full-length cDNA sequence encoding geranylgeranyl diphosphate synthase (GGDPS) was isolated from transcriptome database of tea plant, cloned fromTieguanyin and named as. The cDNA length ofwas 1?661?bp, with an open reading frame (ORF) of 1?137?bp and deduced protein of 378 amino acids. The protein was deduced to contain 5 conserved domains with 2 functional domains of Isoprenoid-Biosyn-C1 superfamily. The sequence analysis showed that CsGGDPS was highly conserved and had the closest genetic relationship with. CsGGDPS was an instability and hydrophilic protein, which was predicted to be located in chloroplast but with no transmembrane structure and signal peptide. There were 20 phosphorylation sites within the polypeptide chain. Alpha helix was predicted to be the major secondary structure of CsGGDPS. The three-dimension structure of CsGGDPS was highly similar to GGPPS11 from. The quantitative real-time PCR showed thatexpression was increased during the developmental process and increased with the age of tea leaves. Meanwhile, its expression was also enhanced during the Zuoqing procedure.was ubiquitously expressed in theHuangdan,Tieguanyin and their first filial generationJinguanyin, but with different expression levels.

, GGDPS, tea aroma, gene expression

S571.1；Q946.5

A

1000-369X(2017)01-086-11

2016-08-01

2016-08-23

國(guó)家自然科學(xué)基金（31600555）、福建省“2011協(xié)同創(chuàng)新中心”中國(guó)烏龍茶產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心專項(xiàng)（閩教科〔2015〕75號(hào)）、福建茶產(chǎn)業(yè)農(nóng)技推廣服務(wù)試點(diǎn)建設(shè)（KNJ-151001）。

姚雪倩，女，碩士研究生，主要從事茶樹(shù)栽培育種與生物技術(shù)研究。