亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐 輝，張俊艷，徐海燕，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

乳桿菌酵母菌及混菌對(duì)發(fā)酵飼料品質(zhì)的影響

亓秀曄，謝全喜，陳 振，于佳民，徐 輝，張俊艷，徐海燕，谷 巍

（山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司，山東泰安271000）

該研究分別用乳桿菌和酵母菌單菌及混菌對(duì)哺乳母豬全價(jià)飼料進(jìn)行固體發(fā)酵，通過測(cè)定發(fā)酵飼料pH值、活菌數(shù)、總酸含量和酸溶蛋白含量，篩選出適宜哺乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳酸桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042，并對(duì)篩選出的乳酸桿菌和酵母菌復(fù)配發(fā)酵進(jìn)行了初步研究。結(jié)果表明，以BLCC2-0015+BLCC4-0021（3:2）復(fù)配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24 h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41%，總酸含量可達(dá)20.68 mg/g。

乳桿菌；酵母菌；發(fā)酵飼料；酸溶蛋白含量；總酸；厭氧發(fā)酵

近年來(lái)，利用微生物發(fā)酵技術(shù)來(lái)開發(fā)新型飼料資源越來(lái)越受到人們的重視。通過微生物發(fā)酵，可使飼料或者飼用原料中含有更多的活性益生菌菌體、各種消化酶及代謝產(chǎn)物、蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物及活性小肽、抑菌物質(zhì)，同時(shí)使飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量降低，起到促進(jìn)生長(zhǎng)、維持動(dòng)物健康的作用[1-2]。

常用的微生物發(fā)酵菌種主要是乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌[3]。乳酸菌發(fā)酵飼料可以降低仔豬胃內(nèi)的酸度，增加仔豬的采食量，從而提高其生產(chǎn)性能[4]，同時(shí)，能有效抑制有害細(xì)菌的生長(zhǎng)和繁殖，控制仔豬的腹瀉，減少抗生素的使用，具有良好的生產(chǎn)和應(yīng)用價(jià)值[5]；酵母菌富含蛋白質(zhì)、氨基酸（粗蛋白質(zhì)含量高達(dá)50%）及多種維生素，同時(shí)含有多種動(dòng)物所需的消化酶（α-淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶等）和其他代謝產(chǎn)物[6-7]，在提高動(dòng)物的免疫、生長(zhǎng)和繁殖能力方面具有顯著功效，是天然綠色生物飼料添加劑，價(jià)格低廉并有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，市場(chǎng)需求旺盛，具有很好的應(yīng)用前景[8]；酸溶蛋白即分子質(zhì)量較低的蛋白水解物，包括肽和游離氨基酸，使用酸溶蛋白含量指標(biāo)評(píng)價(jià)發(fā)酵酶解粕類蛋白質(zhì)品質(zhì)，既可以反映其中抗原蛋白質(zhì)和其他蛋白質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子被水解的程度，進(jìn)而揭示該類抗?fàn)I養(yǎng)因子活性被消除的程度，又可一定程度上反映肽含量的高低[9]，表明畜禽生長(zhǎng)必需氨基酸含量增加，發(fā)酵飼料中氨基酸組成在向優(yōu)質(zhì)化方向轉(zhuǎn)化[10]。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物發(fā)酵飼料在畜禽飼養(yǎng)中的應(yīng)用和理論研究較多。但國(guó)內(nèi)外對(duì)發(fā)酵飼料的研究主要集中在發(fā)酵菌株類型、生理功能[11]、飼喂效果上[12-13]，對(duì)影響發(fā)酵飼料品質(zhì)的發(fā)酵方式、生產(chǎn)工藝條件、發(fā)酵眾多代謝物質(zhì)的活性成分分析等研究相對(duì)較少，對(duì)發(fā)酵飼料眾多代謝產(chǎn)物的有效成分缺乏較深入的研究[14-15]。本試驗(yàn)旨在研究適宜哺乳母豬全價(jià)飼料發(fā)酵的乳桿菌和酵母菌的篩選和復(fù)配發(fā)酵方式對(duì)發(fā)酵飼料pH、活菌數(shù)、總酸含量、粗蛋白和酸溶蛋白含量的影響，為乳桿菌和酵母菌發(fā)酵全價(jià)飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)酵基料和菌株

玉米豆粕型配合飼料：山東泰安普瑞納飼料有限公司。

6株乳桿菌菌株（BLCC2-0001、BLCC2-0015、BLCC2-0038、BLCC2-0092、BLCC2-0111、BLCC2-0114；4株酵母菌菌株（BLCC4-0048、BLCC4-0021、BLCC4-0044、BLCC4-0042）：由山東寶來(lái)利來(lái)生物工程股份有限公司研究院保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母膏4g/L，硫酸鎂0.5 g/L，硫酸錳0.3 g/L，檸檬酸銨2 g/L，乙酸鈉5g/L，吐溫-801mL/L，pH值6.0，121℃滅菌20min。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏0.5g/L，磷酸二氫鉀2.0g/L，pH自然，121℃滅菌20min。

1.1.3 化學(xué)試劑

葡萄糖：山東祥瑞藥業(yè)有限公司；蛋白胨：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；牛肉膏、酵母膏：天津市英博生化試劑有限公司；硫酸鎂、硫酸錳：濟(jì)南匯豐達(dá)化工有限公司；檸檬酸銨：上海撫生實(shí)業(yè)有限公司；乙酸鈉：青島捷世康生物科技有限公司；吐溫-80、氫氧化鈉：天津凱通化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉：天津博迪化工股份有限公司；LBS瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基：青島海博生物技術(shù)有限公司。所用實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；THZ-C恒溫振蕩器：揚(yáng)州培英實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國(guó)華電器有限公司；KDN-103F自動(dòng)定氮儀、HYP-1008八孔消化爐：上海纖檢儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌和乳桿菌發(fā)酵液的制備

將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL YEPD培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用；將4℃條件下保存的乳桿菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的鹽水瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用。

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）乳桿菌的篩選

稱取一定量的基料按料水比1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100 g/袋裝袋，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，壓實(shí)后于37℃培養(yǎng)箱進(jìn)行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)和總酸含量。

（2）酵母菌的篩選

稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1∶0.4（g∶mL），裝量50 g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)平行，以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，置于30℃培養(yǎng)箱進(jìn)行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定活菌數(shù)和粗蛋白含量。

（3）混菌發(fā)酵

將上述篩選得到的乳桿菌和酵母菌進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，料水比為1∶0.4（g∶mL），以裝袋量為100 g/袋裝袋，接種量2%，乳桿菌:酵母菌（3∶2），生料發(fā)酵，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，分別于發(fā)酵24 h、48 h和72 h取樣，測(cè)定pH值、活菌數(shù)、總酸、粗蛋白和酸溶蛋白含量。

1.3.3 測(cè)定方法

pH測(cè)定：取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測(cè)定。

乳桿菌和酵母菌活菌數(shù)的測(cè)定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計(jì)算樣品中乳桿菌和酵母菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。

總酸含量的測(cè)定：參照國(guó)標(biāo)GB/T 12456—2008《食品中總酸的測(cè)定》中的酸堿滴定法測(cè)定。

粗蛋白含量：參照國(guó)標(biāo)GB/T 6432—1994《飼料中粗蛋白測(cè)定方法》測(cè)定。

酸溶蛋白含量：參照QB/T 2653—2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g，加入15%三氯乙酸溶液25 mL，混合均勻，靜置30 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4 000 r/min條件下離心10 min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白的測(cè)定方法。結(jié)果為占粗蛋白的百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響見表1。由表1可知，發(fā)酵24 h時(shí)除菌株BLCC2-0038發(fā)酵pH較高外，其余均在5以下，均顯著低于對(duì)照組（P＜0.05），其中以菌株BLCC2-0015最低；48 h和72 h時(shí)，各pH值均有所下降，以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092較低，菌株BLCC2-0015在發(fā)酵48 h時(shí)pH值達(dá)到最低，僅為4.12。各菌株發(fā)酵活菌數(shù)均在109CFU/g水平，各取樣時(shí)間點(diǎn)時(shí)均以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092活菌數(shù)較高，其中菌株BLCC2-0092發(fā)酵48 h活菌數(shù)達(dá)到81×108CFU/g。各菌株發(fā)酵料總酸含量均逐漸升高，以菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092的總酸含量一直處于較高水平，均顯著高于其他組（P＜0.05）。其中以菌株BLCC2-0015發(fā)酵72 h時(shí)最高，為24.84 mg/g。

綜合考慮，選擇適宜哺乳母豬全價(jià)料發(fā)酵的乳桿菌為菌株BLCC2-0015和菌株BLCC2-0092。

表1 乳桿菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響Table 1 Effect ofLactobacilluson fermented feed quality

2.2 酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

表2 酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響Table 2 Effect of yeast on fermented feed quality

酵母菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響見表2。由表2可知，菌株BLCC4-0048在發(fā)酵24 h、48 h和72 h時(shí)活菌數(shù)均在108CFU/g水平，其余菌株均在109CFU/g水平。24 h以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，其次是菌株BLCC4-0042；48 h和72 h時(shí)均以菌株BLCC4-0021發(fā)酵活菌數(shù)最高，72 h時(shí)為53.50×108CFU/g；其次是菌株BLCC4-0042，兩者間差異不顯著（P＞0.05）。由粗蛋白含量來(lái)看，各菌株間差異均不顯著（P＞0.05），其中以菌株BLCC4-0021和菌株BLCC4-0042發(fā)酵時(shí)稍高。

綜合考慮，選擇適宜作為發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)飼料的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042。

2.3 混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響

利用篩選得到的乳桿菌BLCC2-0015、BLCC2-0092和酵母菌BLCC4-0021、BLCC4-0042混菌發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)飼料，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵（乳桿菌/酵母菌為3∶2，接種量2%），發(fā)酵溫度為32℃。以不接種任何菌株的空白料為對(duì)照，考察混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響，結(jié)果見表3。

表3 乳桿菌酵母菌混菌發(fā)酵對(duì)飼料品質(zhì)的影響Table 3 Effects of multi-strains ofLactobacillusand yeast on fermented feed quality

由表3可知，R0015+J0021、R0015+J0042發(fā)酵各時(shí)間點(diǎn)的pH值均顯著低于R0092+J0021、R0092+J0042厭氧聯(lián)合發(fā)酵（P＜0.05）。各復(fù)配組在各時(shí)間點(diǎn)的乳桿菌活菌數(shù)均在109CFU/g水平，且R0015復(fù)配發(fā)酵時(shí)乳酸桿菌活菌數(shù)較高；24 h時(shí)R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵活菌數(shù)顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵時(shí)（P＜0.05）。且隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)呈下降趨勢(shì)，發(fā)酵72 h時(shí)酵母菌活菌數(shù)低于接種量。R0015+J0021和R0015+J0042發(fā)酵組粗蛋白含量均高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵組，其中24 h和48 h時(shí)差異顯著（P＜0.05）。酸溶蛋白含量和總酸含量結(jié)果一致，R0015+J0021和R0015+J0042復(fù)配發(fā)酵組均顯著高于R0092+J0021和R0092+J0042復(fù)配發(fā)酵組（P＜0.05）；R0015+J0021最高。

綜合考慮，選擇乳桿菌BLCC2-0015與酵母菌BLCC4-0021（3:2）聯(lián)合發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)料效果最優(yōu)。發(fā)酵24h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41%，總酸含量可達(dá)到20.68 mg/g。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)菌種庫(kù)保存的性能優(yōu)良的乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵哺乳母豬全價(jià)料飼料，根據(jù)發(fā)酵后飼料pH值、活菌數(shù)、粗蛋白、酸溶蛋白和總酸等指標(biāo)，篩選出適宜發(fā)酵的乳桿菌為BLCC2-0015和BLCC2-0092，適宜發(fā)酵的酵母菌為BLCC4-0021和BLCC4-0042。混菌發(fā)酵時(shí)，以BLCC2-0015+BLCC4-0021（3：2）復(fù)配組效果最優(yōu)，發(fā)酵24 h時(shí)，乳桿菌活菌數(shù)可達(dá)67.00×108CFU/g，粗蛋白含量高出對(duì)照組45.41%，酸溶蛋白含量高出對(duì)照組23.41%，總酸含量可達(dá)20.68 mg/g。

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Effect of Lactobacillus,yeast and multi-strains fermentation on fermented feed quality

QI Xiuye,XIE Quanxi,CHEN Zhen,YU Jiamin,XU Hui,ZHANG Junyan,XU Haiyan,GU Wei(Shandong BaoLai-LeeLai Bioengineering Co.,Ltd.,Taian 271000,China)

By the determination of pH,viable count,total acid content and acid-soluble protein content of fermented feed,the effect of single strain of Lactobacillusand yeast and multi-strains with solid-state fermentation on lactating sow complete feed was researched.Results showedLactobacillus BLCC2-0015,BLCC2-0092 and yeast BLCC4-0021,BLCC4-0042 were suitable for basic feed fermentation,and multi-strains fermentation conditions with screenedLactobacillusand yeast were preliminary studied.Results indicated that multi-strains BLCC2-0015 and BLCC4-0021(3:2)had the optimal effect,the viable count reached to 67.00×108CFU/g with fermentation time 24 h,the crude protein and acid-soluble protein increased 45.41%and 23.41%than the control group,respectively,and the total acid content was 20.68 mg/g.

Lactobacillus;yeast;fermented feed;acid-soluble protein contents;total acid;anaerobic fermentation

TQ920.6

0254-5071（2017）01-0075-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.015

2016-09-07

泰安市科技發(fā)展計(jì)劃(201540701)

亓秀曄（1987-），女，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物微生態(tài)制劑研發(fā)工作。