張萬(wàn)利，梁新紅*，冉軍艦，孫俊良，莫海珍

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

SLE結(jié)合GC-MS法測(cè)定葡萄酒中氨基甲酸乙酯

張萬(wàn)利，梁新紅*，冉軍艦，孫俊良，莫海珍

（河南科技學(xué)院食品學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

建立了固液萃?。⊿LE）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法測(cè)定葡萄酒中氨基甲酸乙酯（EC）含量的檢測(cè)方法。以硅藻土為吸附劑，二氯甲烷為萃取溶劑，對(duì)葡萄酒中氨基甲酸乙酯進(jìn)行萃取。結(jié)果表明，二氯甲烷用量為70 mL，酒樣中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于12%，萃取效果最佳。EC在200～1 600 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.997 9）。加標(biāo)回收率為91.30%～99.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.26%～1.98%，方法的精密度RSD值為1.61%～3.06%。表明該方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性和精密度良好，適合用于葡萄酒樣品中EC含量的檢測(cè)。

固液萃?。粴庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用法；葡萄酒；氨基甲酸乙酯

葡萄酒釀造過(guò)程中，瓜氨酸和尿素等物質(zhì)和乙醇自發(fā)反應(yīng)會(huì)生成致癌物氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）[1-2]，其為2A類致癌物[3]，加拿大、美國(guó)等國(guó)家對(duì)葡萄酒中EC含量規(guī)定了限量標(biāo)準(zhǔn)，世界衛(wèi)生組織提議世界各國(guó)規(guī)定酒類飲料中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)。

目前，葡萄酒中EC含量的檢測(cè)多采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrography，GC-MS）法[4-5]。應(yīng)用GC-MS方法檢測(cè)食品中痕量成分的前處理過(guò)程不僅耗時(shí)、操作過(guò)程繁瑣，而且較易引入分析誤差，因此，選用的樣品前處理方法直接影響到GC-MS儀器分析的成本、準(zhǔn)確性和實(shí)用性。樣品前處理方法主要有液/液萃取（liquid liquidextraction，LLE）、固相萃取（solidphaseextraction，SPE）、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）等[6-11]。

液/液萃取是傳統(tǒng)的GC分析的前處理方法，其操作過(guò)程簡(jiǎn)單，但因作為萃取劑的有機(jī)溶劑和水相存在乳化現(xiàn)象，分析結(jié)果的精密度及準(zhǔn)確度均較低。固相萃取法是基于液相色譜理論的一種分離純化方法，雖然沒(méi)有出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，但萃取劑消耗量大[6,14-15]。固相微萃取方法簡(jiǎn)便、快速且不需萃取溶劑，但方法的精密度和準(zhǔn)確度較低[8-9]。因此前處理方法中減少萃取溶劑消耗量且提高檢測(cè)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度是GC-MS檢測(cè)中亟待解決的重要關(guān)鍵問(wèn)題。固液萃取是將具有高效、高選擇性和吸附性的硅藻土和待測(cè)樣品混合均勻，置入玻璃色譜層析柱中，然后用萃取溶劑以一定的速率進(jìn)行洗脫目標(biāo)檢測(cè)物的方法。目前，少見(jiàn)固液萃取應(yīng)用于GC-MS分析前處理方法的文獻(xiàn)報(bào)道。

本研究采用SLE前處理方法對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行萃取，結(jié)合GC-MS法檢測(cè)葡萄酒中EC含量。以期快速準(zhǔn)確測(cè)定葡萄酒中EC含量，為葡萄酒質(zhì)量控制提供技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品：市售；氨基甲酸乙酯（純度＞99%）、丙酮（色譜純，純度≥99.9%）、乙醇（色譜純，純度≥99.8%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；氨基甲酸丙酯（n-propyl carbamate，nPC）（純度＞98%）：美國(guó)Sigma公司；Celite 545 coarse硅藻土：美國(guó)Fluka公司；二氯甲烷（分析純）：上海恒岳化工科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Trace GC ultra-DSQ GC-MS：美國(guó)Finnigan公司；DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司；SENCO W201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申生科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 EC模式溶液和nPC內(nèi)標(biāo)溶液的配制[14]

將一定量的EC和nPC標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于色譜級(jí)丙酮中，分別配制成10 000 μg/L的EC丙酮溶液和nPC丙酮溶液，備用。分別取4.0 mL 10 000 μg/L的EC丙酮溶液和8.0 mL 10 000 μg/L的nPC丙酮溶液，充分混勻，然后用蒸餾水稀釋至100 mL，稀釋后溶液即為EC模式溶液，溶液中EC和nPC含量分別為0.4 μg/mL和0.8 μg/mL。

取含量為10 000 μg/L的nPC丙酮溶液8 mL，用蒸餾水稀釋至100 mL，即為800 μg/L的nPC內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3.2 SLE操作方法及EC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

EC-nPC標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：用蒸餾水將EC丙酮溶液（10.0 μg/mL）和nPC丙酮溶液（10.0 μg/mL）進(jìn)行稀釋，得到以下不同含量的EC-nPC標(biāo)準(zhǔn)溶液：0.2μg/mLEC+0.8μg/mL nPC、0.4 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC、0.8 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC和1.6 μg/mL EC+0.8 μg/mL nPC。

SLE操作方法及EC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取各含量的EC-nPC標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL于燒杯中，與19.0 mL蒸餾水混合均勻，緩慢加入20.0 g硅藻土，充分?jǐn)嚢杈鶆?。將混合好的EC-nPC-硅藻土混合物裝入玻璃色譜層析柱中，用二氯甲烷進(jìn)行洗脫，二氯甲烷流速為2 mL/min，洗脫液用蒸餾燒瓶進(jìn)行收集。洗脫液收集完畢，用10.0 g無(wú)水硫酸鈉除去洗脫液中的水分，備用。

除去水分后的洗脫液在30℃下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮，蒸餾燒瓶中洗脫液濃縮至4.0 mL后移至KD濃縮瓶中，用2.0 mL二氯甲烷潤(rùn)洗蒸餾燒瓶，潤(rùn)洗液完全轉(zhuǎn)入KD瓶中，KD瓶中溶液在30℃下濃縮至1.0 mL后，完全移入1.0 mL離心管中。各梯度濃縮液進(jìn)行GC-MS分析。以EC含量為橫坐標(biāo)（x），EC-nPC的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得EC標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

葡萄酒樣品中EC的含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程和濃縮倍數(shù)計(jì)算，計(jì)算公式如下：

式中：X為葡萄酒樣品中EC含量，μg/L；x為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的EC含量，μg/mL；n為濃縮倍數(shù)。

1.3.3 GC-MS分析參數(shù)[6]

氣相色譜分析條件：DB-WAX毛細(xì)管色譜柱（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度190℃，柱溫程序：初溫40℃，保持2min，然后以10℃/min升至180℃，保持0.5min，再以50℃/min的速度升至220℃，保持4 min。載氣為高純氦氣（純度＞99.999%），流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1.0 μL。

質(zhì)譜分析條件：電子電離（electron ionization，EI）離子源，離子源溫度220℃；電子能量70 eV；接口溫度220℃；電子倍增電壓1 568 V；檢測(cè)離子m/z 62、74、89，定量離子m/z 62；溶劑延遲10 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 二氯甲烷用量對(duì)EC萃取的影響

選擇二氯甲烷為萃取溶劑，對(duì)模式溶液中EC萃取后進(jìn)行GC-MS分析，考察二氯甲烷用量為50～90 mL時(shí)對(duì)EC萃取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 二氯甲烷用量對(duì)EC萃取效果的影響(n=3)Fig.1 Effect of dichloromethane dosage on EC extraction efficiency (n=3)

由圖1可知，隨著二氯甲烷用量增加，EC-nPC峰面積比值迅速上升，這是因?yàn)殡S著二氯甲烷用量的增加，EC-nPC-硅藻土混合物中更多的EC被二氯甲烷萃取出來(lái)。但當(dāng)二氯甲烷用量由70 mL增至90 mL時(shí)，EC-nPC峰面積比值變化不顯著（P＜0.05），表明EC-nPC-硅藻土混合物中EC已經(jīng)完全被二氯甲烷萃取。與李華等[6]報(bào)道的固相萃取前處理方法相比較，SLE方法中二氯甲烷用量減少了150.00%。因此，選擇70 mL二氯甲烷作為萃取溶劑。

2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)模式溶液中EC萃取的影響

研究表明，檢測(cè)酒精飲料中EC含量時(shí)，乙醇對(duì)EC檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度和精確度均有較大影響[15]。因此，向模式溶液中添加乙醇，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%～21%時(shí)對(duì)模式溶液中EC萃取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為3%～12%時(shí)，EC-nPC峰面積比值在（0.528±0.031）～（0.532±0.041）范圍內(nèi)變化，且差異不顯著（P＞0.05），隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)升高，EC-nPC峰面積比值開(kāi)始下降，可能是因?yàn)橐掖己虴C對(duì)硅藻土的競(jìng)爭(zhēng)吸附，也可能是乙醇會(huì)包裹EC形成微膠團(tuán)，導(dǎo)致EC的揮發(fā)性降低。因此，應(yīng)用SLE對(duì)葡萄酒樣進(jìn)行萃取時(shí)，酒樣乙醇體積分?jǐn)?shù)應(yīng)低于12%，如果酒樣中乙醇體積分?jǐn)?shù)高于12%，應(yīng)對(duì)酒樣進(jìn)行適當(dāng)稀釋。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)EC萃取效果的影響(n=3)Fig.2 Effect of ethanol content on EC extraction efficiency(n=3)

2.3 EC標(biāo)準(zhǔn)品及樣品GC-MS色譜圖

在葡萄酒EC含量檢測(cè)時(shí)，EC的總離子掃描質(zhì)譜中，特征離子m/z 62為葡萄酒中EC含量檢測(cè)的定量離子。依據(jù)1.3.3的方法，分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄酒樣品進(jìn)行GC-MS分析，獲得EC的總離子流色譜圖如圖3所示。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液(a)及葡萄酒樣(b)中EC總離子流色譜圖Fig.3 Total ions chromatograms of EC in standard solution(a)and wine sample(b)

由圖3可知，標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄酒樣品中EC保留時(shí)間分別為13.31 min和13.34 min，分離效果較好，峰形良好，雜峰干擾少，可以用于實(shí)際樣品中EC含量的檢測(cè)。

2.4 EC標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照1.3.2操作方法，二氯甲烷用量為70 mL，應(yīng)用SLE方法對(duì)系列標(biāo)準(zhǔn)溶液中EC進(jìn)行萃取，并進(jìn)行GC-MS分析，以EC含量為橫坐標(biāo)（x），EC-nPC的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y），繪制EC標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Standard curve of ethyl carbamate

由圖4可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.607 7x+0.011 2，相關(guān)系數(shù)為R2=0.997 9，結(jié)果表明，在0.2～1.6 μg/mL范圍內(nèi)，EC含量和EC-nPC的峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

取葡萄酒樣品，分別加入20 μg/L、40 μg/L、60 μg/L的EC標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.2處理方法，采用GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD），樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 1 Results of adding standard recovery rate tests(n=3)

由表1可知，EC的加標(biāo)回收率為91.30%～99.90%，RSD值為1.26%～1.98%，表明方法準(zhǔn)確度較高，可以用于檢測(cè)葡萄酒中EC含量的檢測(cè)。

2.6 方法精密度試驗(yàn)

取EC含量分別為0.2 μg/mL、0.4 μg/mL、0.8 μg/mL、1.6 μg/mL的溶液，根據(jù)建立的測(cè)定條件，分別測(cè)定6次，計(jì)算4個(gè)溶液樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Table 2 Results of precision tests(n=6)

由表2可知，應(yīng)用建立的方法測(cè)定4個(gè)樣品溶液中EC含量，測(cè)定結(jié)果的RSD在1.61%～3.06%，表明該方法的精密度較好。

2.7 葡萄酒中氨基甲酸乙酯的測(cè)定

應(yīng)用所建立的方法測(cè)定6個(gè)葡萄酒樣品中氨基甲酸乙酯的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 葡萄酒中EC含量檢測(cè)結(jié)果Table 3 Determination results of EC content in wine

由表3可知，利用SLE前處理結(jié)合GC-MS方法檢測(cè)不同類型的葡萄酒中EC含量，檢測(cè)值在（8.29±0.32）～（35.96±0.95）μg/L，說(shuō)明該方法能夠用于不同類型葡萄酒中EC含量的檢測(cè)。測(cè)定的6個(gè)葡萄酒樣品中，其中5個(gè)樣品的EC含量低于加拿大衛(wèi)生與預(yù)防部門規(guī)定的30 μg/L。

3 結(jié)論

本研究建立了SLE前處理結(jié)合GC-MS檢測(cè)葡萄酒中EC含量新方法。應(yīng)用固液萃取法萃取葡萄酒中EC時(shí)二氯甲烷用量為70 mL，酒樣中乙醇體積分?jǐn)?shù)低于12%，萃取效果最佳。EC含量在0.2～1.6 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（R2=0.997 9）。加標(biāo)回收率為91.30%～99.90%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%～1.98%。方法的精密度RSD值為1.61%～3.06%。SLE方法準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。建立的葡萄酒中EC含量檢測(cè)方法不出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，有機(jī)溶劑用量少，方法準(zhǔn)確可靠，可用于葡萄酒樣品中EC含量的檢測(cè)，對(duì)葡萄酒質(zhì)量控制具有重要意義。

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Determination of ethyl carbamate in wine by SLE combined with GC-MS

ZHANG Wanli,LIANG Xinhong*,RAN Junjian,SUN Junliang,MO Haizhen(School of Food Science,Henan Institute of Science and Technology,Xinxiang 453003,China)

The determination method of ethyl carbamate(EC)in wine was established by SLE combined with GC-MS.Using diatomite as adsorbent, dichloromethane as extraction solution,the EC in wine was extracted.The results showed that the optimum extraction conditions were as follow: dichloromethane dosage 70 ml,ethanol content in wine＜12%.EC had a good linear relationship in range of 200-1 600 μg/L(R2=0.997 9),the adding standard recovery rate was 91.30%-99.90%,and relative standard deviation(RSD)was 1.26%-1.98%.The RSD of method precision was 1.61%-3.06%.Due to high accurate,good reproducibility and accuracy,the method could be used for the determination of EC content in wine.

solid liquid extraction;GC-MS;wine;ethyl carbamate

TS261.7

0254-5071（2017）01-0176-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.01.037

2016-07-26

河南省科技計(jì)劃項(xiàng)目(142102110127)；河南省教育廳自然科學(xué)研究資助計(jì)劃項(xiàng)目(14A550010)；河南省高?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃項(xiàng)目(16IRTSTHN007)

張萬(wàn)利(1991-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。

*通訊作者：梁新紅(1971-)，女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。