趙欠，王巧碧，袁敏，周才瓊

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院暨重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

白肉枇杷白蘭地原酒發(fā)酵條件優(yōu)化

趙欠，王巧碧，袁敏，周才瓊*

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院暨重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

采用西南大學(xué)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的“華白1號”白肉枇杷為實驗材料，對枇杷白蘭地原酒發(fā)酵工藝參數(shù)進行了優(yōu)化。通過單因素實驗研究發(fā)酵溫度、糖度、酸度、菌種及含量等因素對白蘭地原酒質(zhì)量的影響，并在單因素實驗基礎(chǔ)上進行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化實驗，確定最優(yōu)的發(fā)酵條件。發(fā)酵結(jié)果表明，0.1%的菌種Y3為所選酵母中最優(yōu)發(fā)酵菌種量，在pH 4.0，糖量23%，發(fā)酵溫度25 ℃時發(fā)酵質(zhì)量最好，各因素對發(fā)酵品質(zhì)影響的主次順序為糖量>pH>溫度，發(fā)酵白肉枇杷白蘭地原酒酒精度為12.4%，殘?zhí)菫?.5%，總酯為0.151 g/L，滴定酸為5.425 g/L。

白肉枇杷；發(fā)酵工藝；響應(yīng)面優(yōu)化；白蘭地原酒

枇杷原產(chǎn)于我國四川省大渡河中下游，在我國南方有大面積栽培[1]；全世界枇杷屬植物種類有34個，共600多個品種，其中140個具有經(jīng)濟價值[2-4]。枇杷果實肉質(zhì)柔軟多汁，味道鮮美可口，含有大量碳水化合物，維生素及多種礦物質(zhì)[5-6]，除了富含胡蘿卜素等，還含包括山梨醇、蘋果酸和綠原酸等功能成分[7-8]，苯乙醛是枇杷鮮果中最有效的揮發(fā)性香味物質(zhì)[9]。近年來，我國在枇杷的馴化改良，栽培，儲藏保存等方面進行了大量的研究[10-12]， 但現(xiàn)有的保藏技術(shù)不能較長時間進行保藏，且儲藏成本較高。枇杷沒有后熟過程且貯藏期較短，亟需對枇杷的加工利用進行研究[4]。本文以“華白一號”白肉枇杷為原料，采用單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化探索枇杷白蘭地原酒釀造工藝，尋求適合枇杷白蘭地的發(fā)酵工藝，為白蘭地的蒸餾和陳釀提供技術(shù)基礎(chǔ)，為生產(chǎn)枇杷白蘭地提供優(yōu)質(zhì)原酒。

1 材料與設(shè)備

1.1 實驗材料及處理

白肉枇杷：西南大學(xué)農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)研究室實驗基地。白砂糖(北碚,永輝超市)。

枇杷汁制備：枇杷分選，清洗，去籽，用0.05%NaHSO3溶液護色，打漿時用0.05%NaHSO3溶液和0.01%異抗壞血酸混合護色榨汁。枇杷原汁中添加0.17 g/kg果膠酶，于40 ℃下水浴4.0 h，然后水浴鍋加熱到90 ℃滅酶15 min。得發(fā)酵用枇杷汁，出汁為率86%。

1.2 主要試劑和儀器

NaHSO3，異抗壞血酸，檸檬酸，檸檬酸鈉，NaOH，H2SO4，酚酞等均為分析純；果膠酶活力≥500 000 U/g。

惠爾普斯果蔬破壁料理機，中山市惠爾普斯電器有限公司；FA2004A電子天平，上海精天電子儀器有限公司；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酵母的活化[13]

稱取蔗糖5 g于250 mL燒杯中，加入100 mL蒸餾水，溶解后于電爐上加熱煮沸，冷卻至35～40 ℃。準(zhǔn)確稱取一定量的釀酒活性干酵母，溶解于上述冷卻的蔗糖水溶液中，在40 ℃水浴鍋中靜置活化20～30 min，每10 min振蕩1次，至有大量氣泡產(chǎn)生時即活化完畢。

1.3.2 枇杷白蘭地原酒發(fā)酵環(huán)境單因素實驗[14]

(1)糖度的影響：取200 g枇杷汁，分別調(diào)整含糖量至19%、22%、25%、28%，pH 4.0，再取于樣液量0.05%的Y3菌種進行活化，在22 ℃下發(fā)酵7 d，檢測。

(2)pH的影響：取200 g枇杷汁于燒杯中；分別用檸檬酸鈉和檸檬酸調(diào)整pH為3.2、3.6、4.4、4.4、4.8，添加糖量至22%，再稱取于樣液量0.05%的Y3菌種進行活化，在22 ℃下發(fā)酵7 d，檢測。

(3)發(fā)酵溫度的影響：取200 g枇杷汁于燒杯中；調(diào)整含糖量為22%，pH 4.0，稱取0.05%的Y3菌種活化接種，分別在16、19、22、25、28 ℃下發(fā)酵7 d，檢測。

1.3.3 枇杷白蘭地原酒發(fā)酵中產(chǎn)香及產(chǎn)酒酵母的選擇

1.3.3.1 不同酵母菌種的影響

取200 g枇杷汁于燒杯中；調(diào)整含糖量為22%，pH 4.0，再分別稱取汁液量0.05%的Y1、Y2、Y3、Y4和Y5五種酵母菌種進行活化，在25 ℃下發(fā)酵7 d，檢測。

1.3.3.2 發(fā)酵酵母量的影響

取200 g枇杷汁于燒杯中；分別調(diào)整含糖量為22%，pH為 4.0，分別取發(fā)酵性能最好的菌種Y3量為枇杷汁的0.025%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%進行活化，接種，在25 ℃下發(fā)酵7 d，檢測。

1.3.3.3 釀酒酵母與產(chǎn)香酵母結(jié)合的影響

取200 g枇杷汁于燒杯中；調(diào)整含糖量為22%，pH為4.0。再取-18 ℃保存下的產(chǎn)香酵母進行預(yù)處理并在25 ℃下發(fā)酵枇杷液，分別在產(chǎn)香酵母發(fā)酵的第0、1、2 d加入活化的Y3，發(fā)酵至無氣泡產(chǎn)生，測其酒精度和總酯含量。

1.3.4 響應(yīng)面法優(yōu)化枇杷白蘭地原酒發(fā)酵條件

在1.3.2和1.3.3試驗基礎(chǔ)上，設(shè)計Box-Benhnken響應(yīng)面3因素3水平實驗方案，在固定發(fā)酵菌種和接種量基礎(chǔ)上，選擇初始pH(A)、初始糖度(B)、發(fā)酵溫度(C)為響應(yīng)面優(yōu)化考察因素，以酒精度(20 ℃)和總酯含量為響應(yīng)值設(shè)計中心組合實驗設(shè)計，用Design-Expert8.0軟件進行數(shù)據(jù)處理以確定枇杷白蘭地原酒釀造的最佳工藝條件參數(shù)，各因素編碼及水平編碼見表1。

1.3.5 測定方法

酒精度：GB/T 15038—2006；總酸：GB/T 15038—2006；總酯：GB/T 15038—2006；殘?zhí)橇浚菏殖终厶莾x測定。

表1 響應(yīng)面試驗自變量因素及水平編碼表

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

每個樣品重復(fù)測定3次，試驗結(jié)果以 mean±SD 表示，用Origin 8.6作圖，用SPSS 19.0進行單因素方差分析及Duncan法做多重比較，分析數(shù)據(jù)間的顯著性差異，用Design-Expert8.0軟件對響應(yīng)面數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷白蘭地原酒發(fā)酵環(huán)境因素單因素實驗

2.1.1 發(fā)酵糖度的影響

實驗結(jié)果如表1，隨枇杷汁糖度升高，殘?zhí)橇恐饾u增加，酒精度呈現(xiàn)先增后略降趨勢;糖度在22%時酒精度最高，顯著高于其他各處理(P<0.05)，糖度增加酒精含量反而降低，可能與高糖抑制酵母產(chǎn)酒代謝有關(guān)。

圖1 不同糖度對發(fā)酵酒質(zhì)的影響Fig.1 Influence on the quality of fermented wine in different sugar

2.1.2 發(fā)酵pH的影響

實驗結(jié)果如圖2，隨著發(fā)酵枇杷汁pH增加，酒精度和殘?zhí)蔷尸F(xiàn)先增后降趨勢，酒精度在pH4.0～4.4時較高，顯著高于其他處理。滴定酸則隨著pH升高而逐漸下降，考慮一定的酸度可抑制雜菌，還能賦予基酒以良好的風(fēng)味，將pH值為4.0設(shè)為最佳發(fā)酵pH值。

圖2 不同酸度對發(fā)酵酒質(zhì)的影響Fig.2 Influence on the quality of fermented wine in different acidity

2.1.3 發(fā)酵溫度的影響

實驗結(jié)果如圖3，16 ℃發(fā)酵7 d后，由于溫度低，發(fā)酵不完全，酒精度低，殘?zhí)橇扛?。發(fā)酵溫度在19～25 ℃時，隨著溫度的升高，酒精度隨之升高。25～28 ℃下酒精度顯著高于其他溫度處理，滴定酸含量波動變化明顯。考慮溫度過高時，釀酒酵母自身生長繁殖過快，可消耗過多糖量，易于衰老和死亡，以25 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖3 不同溫度對發(fā)酵酒質(zhì)的影響Fig.3 Influence on the quality of fermented wine in different temperature

圖4 不同菌種發(fā)酵期間失重量Fig.4 Lose weight in fermented time with different species

2.2 產(chǎn)香及產(chǎn)酒酵母對枇杷白蘭地原酒發(fā)酵的影響

2.2.1 不同菌種的影響

不同菌種發(fā)酵期間失重情況如圖4。Y3、Y4和Y5菌種前期發(fā)酵速度快，發(fā)酵時間短；Y1，Y2發(fā)酵時間長，前期發(fā)酵強度小。Y3在第2天失重最大，發(fā)酵在第6天完成。Y3、Y4和Y5發(fā)酵液酒精度顯著高于其他發(fā)酵菌種，滴定酸顯著低于其他菌種；殘?zhí)橇吭?%～8%之間(表2)。綜合比較，選Y3為發(fā)酵酵母菌種。

2.2.2 發(fā)酵菌種接種量的影響

實驗結(jié)果如圖5示，菌種接種量對發(fā)酵液的滴定酸沒有顯著性差異(P>0.05)；接種量的0.1%～0.3%時殘?zhí)橇匡@著低于0.025%～0.05%接種量的殘?zhí)橇?P<0.05)；酒精度之間差異不大，峰值則是0.1%接種量。綜合比較，菌種接種量選擇在0.1%。

表2 不同菌種對發(fā)酵酒質(zhì)的影響

注：*表中的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±SD表示，每列中的不同字母代表在0.05水平上差異顯著。

圖5 不同菌種量對發(fā)酵質(zhì)量的影響Fig.5 Influence on the quality of fermented wine with different contents of species

2.2.3 產(chǎn)香酵母與釀酒酵母復(fù)合對發(fā)酵的影響

先取-18 ℃保存下的產(chǎn)香酵母進行預(yù)處理并接種發(fā)酵，分別在產(chǎn)香酵母發(fā)酵的第0、 1、2天加入活化的釀酒酵母Y3，發(fā)酵至無氣泡產(chǎn)生。結(jié)果如圖6。釀酒酵母Y3單獨發(fā)酵時酒精度最高；酯含量以產(chǎn)香酵母處理后第2天加入活化酵母發(fā)酵為高，但不同處理產(chǎn)酯量間無顯著性差異(P>0.05)。從經(jīng)濟和實驗操作綜合比較，釀酒酵母Y3單獨發(fā)酵為最合適的發(fā)酵方式。

圖6 產(chǎn)香酵母與釀酒酵母復(fù)合的影響Fig.6 Influence on the quality of fermented wine with different combine ways of Saccharomyces cerevisiaes and fragrant grains

2.3 枇杷白蘭地原酒發(fā)酵條件的響應(yīng)面優(yōu)化

由以上實驗可知，選擇菌種Y3，以接種量0.1%為基礎(chǔ)，對枇杷白蘭地原酒發(fā)酵環(huán)境條件(pH、糖度、溫度)進行響應(yīng)面優(yōu)化，以A=(X-4)/0.4，B=(X-22)/3，C=(X-25)/3 為自變量, 以酒精度及酯含量為響應(yīng)值進行實驗。實驗方案及結(jié)果見表3，試驗號1～12 是析因試驗，試驗號13～15 是中心試驗。15個試驗點分為析因和零點，其中析因點為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點；零點為區(qū)域的中心點，零點實驗重復(fù)3次，用以估計實驗誤差。多項式模型方程擬合可靠性由R2表達，統(tǒng)計學(xué)上的顯著性由F值檢驗。影響因素的線性效應(yīng)、平方效應(yīng)及其交互效應(yīng)的顯著性由模型系數(shù)的P值檢驗。

表3 枇杷酒發(fā)酵的響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果

2.3.1 以酒精度為響應(yīng)值的結(jié)果分析

以酒精度為響應(yīng)值的精簡模型方差分析見表4，酒精度回歸方程(模型)的回歸效果極顯著，模型R2=91.93%，說明這種實驗方法可靠，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析是可行的。B、A2、B2對響應(yīng)值酒精度的影響極顯著，說明糖度，pH是發(fā)酵酒精度生成的重要控制因素；各因素對酒精度影響的大小順序為糖度>pH >溫度，AB，AC，BC均P>0.05，表明3個因素之間無交互作用。

各因子交互作用的響應(yīng)面3D圖和等值線圖見圖7～圖9。由圖可知在所選范圍內(nèi)存在極值。圖7表明，溫度和pH交互作用較強；與溫度方向比較，pH效應(yīng)面曲線較陡，沿溫度方向的等高線密度低于沿pH方向的等高線密度，表明溫度對酒精度的影響小于pH對酒精度的影響；在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度達到25 ℃，pH 4.0左右時為此響應(yīng)面頂點。圖8表明溫度和糖度的交互作用較強, 且與溫度方向比較，糖度效應(yīng)面曲線較陡，沿溫度方向的等高線密度小于沿糖度方向的等高線密度，表明溫度對酒精度的影響小于糖度對酒精度的影響；在一定范圍內(nèi)，當(dāng)溫度達到24 ℃，糖度為22%左右時為此響應(yīng)面頂點。圖9表明糖度和糖度的交互作用不顯著，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)pH達4.0，糖度為22%左右時為此響應(yīng)面頂點。

表4 響應(yīng)面試驗結(jié)果的精簡模型方差分析

圖7 溫度和pH對發(fā)酵酒精度影響的響應(yīng)面和等值線圖Fig.7 Three-dimensional response surface diagram and Contour plot showing the alcoholic strength influented by temperature and pH

圖8 溫度和糖度對發(fā)酵酒精度影響的響應(yīng)面和等值線圖Fig.8 Three-dimensional response surface diagram and Contour plot showing the alcoholic strength influented by temperature and suger

圖9 糖度和pH對發(fā)酵酒精度影響的響應(yīng)面和等值線圖Fig.9 Three-dimensional response surface diagram and Contour plot showing the alcoholic strength influented by suger and pH

根據(jù)精簡模型建立二次響應(yīng)面回歸方程為:酒精度=12.06+0.095A+0.53B+0.047C-0.083AB-7.500E-003AC-0.012BC-0.61A2-0.72B2-0.12C2

2.3.2 以酯含量為響應(yīng)值的結(jié)果分析

以酯含量為響應(yīng)值的精簡模型方差分析見表5。由精簡模型的方差分析可知,酯含量回歸方程(模型)的回歸效果不顯著，模型R2=41.83%，說明這種方法不可靠，使用該方程模擬真實的3因子3水平的分析不可行。

因變量酒精度和酯含量經(jīng)軟件Design Expert8.0優(yōu)化分析可知，酒精度可作為響應(yīng)值優(yōu)化試驗工藝，而酯含量由于回歸效果不顯著，R2、模型P值過小，不能作為響應(yīng)值優(yōu)化試驗工藝。由酒精度作為響應(yīng)值得到發(fā)酵實驗的最佳工藝參數(shù)：pH為4.01，糖度為22.07%，溫度為25.52 ℃，預(yù)測理論酒精度為12.17%。

為檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，采用得到的發(fā)酵條件進行枇杷原酒發(fā)酵的驗證實驗，同時考慮到實際操作和生產(chǎn)的便利，以發(fā)酵條件pH4.0，糖量22%，發(fā)酵溫度25℃進行驗證，3 次平行實驗得到的實際平均酒精度12.4%，與理論值接近。因此, 響應(yīng)面法對枇杷原酒發(fā)酵條件的優(yōu)化是可行的。

2.3.3 白肉枇杷白蘭地原酒主要品質(zhì)指標(biāo)

對影響枇杷白蘭地發(fā)酵的各因素進行優(yōu)化，得到最佳的發(fā)酵條件為：0.1%的釀酒酵母Y3在pH4.0，糖量22%，發(fā)酵溫度25 ℃下發(fā)酵7 d，得到較好的枇杷白蘭地原酒。對最佳條件發(fā)酵后的枇杷白蘭地原酒進行各項指標(biāo)檢測，得到：pH值為4.3，滴定酸含量為5.425 g/L，殘?zhí)橇繛?.5%，酒精度為12.4%，酯含量為0.151 g/L。

表5 響應(yīng)面試驗結(jié)果的精簡模型方差分析

3 討論與結(jié)論

本實驗以“華白1號”白肉枇杷為實驗材料，研究菌種及發(fā)酵環(huán)境對枇杷原酒質(zhì)量的影響。對5種不同菌種發(fā)酵枇杷汁的失重量和發(fā)酵后殘?zhí)橇?，酒精度和滴定酸進行檢測，找到相對適合發(fā)酵枇杷白蘭地原酒的酵母為Y3；對影響發(fā)酵質(zhì)量的各因素進行優(yōu)化并在單因素的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面優(yōu)化實驗得到發(fā)酵條件pH 4.0，糖量22%，發(fā)酵溫度25 ℃為最適合的發(fā)酵環(huán)境。采用優(yōu)化工藝發(fā)酵得到的枇杷白蘭地原酒酒精度12.4%，酯含量為0.151 g/L，pH值為4.3，滴定酸含量為5.425 g/L，殘?zhí)橇繛?.5%。由于已對酒精度進行單因素實驗而未對酯含量進行爬坡實驗導(dǎo)致酯含量作為響應(yīng)面的因變量不能得到較好的回歸效果。本研究為下一步對白蘭地原酒進行蒸餾以及陳釀奠定了良好的基礎(chǔ)，為研究優(yōu)質(zhì)枇杷白蘭地的釀造提供依據(jù)。

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Researches on response surface methodology for optimizing fermentation process of brandy raw wine made by white flesh loquat

ZHAO Qian,WANG Qiao-bi,YUAN Min,ZHOU Cai-qiong*

(Engineering & Technology Research Centre of Characteristic Food,Food Science College,Southwest University, Chongqing 400716,China)

White flesh loquat named Huabai No.l with independent intellectual property rights from Southwest University was used as experimental material to optimize fermentation process in this paper. The effects of fermentation temperature, strains of sugar, acidity, species ,the contents of species and other factors on quality of brandy raw wine were studied by single factor experiment. Response surface optimization experiments with three factors and three levels based on single factor experiments were carried out to determine the optimal fermentation conditions. Results showed that fermentation quality is the best at pH4.0, 25 ℃ when 0.1% Y3 was selected as yeast strains and content of sugar was 23%. The fermented wine possessed 12.4% oalcoholic strength, 7.5% sugar，0.151g/L total ester，5.425 g/L total acid . The order of factors influencing fermentation quality was as follow: content of sugar >pH>temperature.

white flesh loquat；fermentation process；brandy raw wine；response surface methodology

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701018

碩士研究生(周才瓊教授為通訊作者,E-mail：zhoucaiqiong@swu.edu.cn)。

重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心能力提升項目(cstc2014pt-gc8001)

2016-06-07，改回日期：2016-08-15