黃建華，王曉姣，魏照輝，張震宇，孫付保

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

大腸桿菌中順式-3-羥脯氨酸羥化酶的定向改造

黃建華，王曉姣，魏照輝，張震宇*，孫付保*

(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

對以L-脯氨酸為底物，產(chǎn)順式-3-羥脯氨酸(cis-3-hydroxyproline, H3P)的羥化酶基因進(jìn)行定向改造。從重組菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-ptrp2-H3P出發(fā)，通過易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變和定點(diǎn)突變處理，利用多孔板和創(chuàng)建的簡易顯色法相結(jié)合的高通量方法篩選出2株H3P高產(chǎn)菌P-2-H3、P-9-D5。經(jīng)基因測序后得到5個(gè)突變位點(diǎn)R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I，并在出發(fā)菌基礎(chǔ)上對此5個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行單一定點(diǎn)突變,得到5個(gè)突變體TBT-R58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I。發(fā)酵24 h測其產(chǎn)量找出3個(gè)優(yōu)勢突變位點(diǎn)。以TBT-R58C為出發(fā)菌，依次對另外2個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。得到TBT-R58C-T83I-H89Y突變體。發(fā)酵24 h產(chǎn)量達(dá)到了1125.3 mg/L。與重組菌相比，TBT-R58C-T83I-H89Y的產(chǎn)量提高了53.6%。

重組大腸桿菌；易錯(cuò)PCR；順式-3-羥脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)；脯氨酸-3-羥化酶；定向改造

羥基-L-脯氨酸(Hydroxyproline, Hyp)是一種亞氨基酸，分子式為C5H9NO3，為L-脯氨酸經(jīng)過羥基化后得到的產(chǎn)物。由于L-脯氨酸有2個(gè)不對稱的碳原子，根據(jù)羥基所在位置的不同，形成的羥脯氨酸可以分為4種立體異構(gòu)體，分別是反式-4-羥脯氨酸、順式-4-羥脯氨酸、反式-3-羥脯氨酸和順式-3-羥脯氨酸(cis-3-hydroxyproline,H3P)。H3P在自然界中十分稀有[1]，現(xiàn)有資料報(bào)道其存在于產(chǎn)放線菌素、宜他霉素和遠(yuǎn)霉素等次級代謝物的微生物中[2]。H3P在醫(yī)藥[3-4]、化學(xué)合成[5]、不對稱合成等領(lǐng)域有著較廣泛應(yīng)用[6]。但其含量的稀少成為限制其應(yīng)用的最主要因素。

隨著微生物資源的開發(fā)和利用，研究者們發(fā)現(xiàn)了一些能夠合成H3P的微生物。1996年，MORI，SHIBASAKI等人在篩選產(chǎn)脯氨酸-4-羥化酶菌株的過程中，發(fā)現(xiàn)鏈霉菌(Streptomycessp.)TH1能夠產(chǎn)一種脯氨酸-3-羥化酶，該酶能夠?qū)⒂坞x的L-脯氨酸羥基化為H3P，之后他們發(fā)現(xiàn)脯氨酸-3-羥化酶還存在于包括產(chǎn)遠(yuǎn)霉素的鏈霉菌和芽孢桿菌等多種微生物體內(nèi)[7]。這也是在微生物中發(fā)現(xiàn)脯氨酸-3-羥化酶的首次報(bào)道。2009年，ROBERT 等通過重組大腸桿菌的構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了脯氨酸-3-羥化酶在大腸桿菌中的異源表達(dá)，20 L發(fā)酵罐發(fā)酵8 h后，加入一定量的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，以收集的菌體為酶源，在10 L的反應(yīng)體系中60 h能夠催化產(chǎn)生H3P約9.1 g/L[8]，這也是目前文獻(xiàn)中報(bào)道的最高水平。

自然界中的酶經(jīng)過百萬年的自然選擇和生物進(jìn)化，擁有的較高特異性與較強(qiáng)催化能力。但由于野生酶已經(jīng)適應(yīng)了自身的作用環(huán)境，其表現(xiàn)的活性及穩(wěn)定性往往無法達(dá)到理想目標(biāo)[9]。隨著科技的發(fā)展，借助突變及重組等技術(shù)，進(jìn)化的過程可以在試管中被模擬，被稱為體外定向進(jìn)化[10]。其在改變底物特異性、增強(qiáng)熱穩(wěn)定性、提高有機(jī)溶劑耐受性、改變對映選擇性等方面有諸多應(yīng)用。

1989年，LEUNG等提出了利用易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)行定向進(jìn)化，由CADWELL等于1992年進(jìn)行了完善和改進(jìn)[11]。易錯(cuò)PCR技術(shù)簡便快捷，主要思路是降低DNA聚合酶的保真度，并于標(biāo)準(zhǔn)PCR條件的基礎(chǔ)上，通過微調(diào)PCR的反應(yīng)體系及條件以增加突變頻率，以此向基因中引入隨機(jī)的堿基突變，從而構(gòu)建具有多樣性序列的突變基因文庫[12]。作為一種有效的定向進(jìn)化手段，隨機(jī)突變結(jié)合高通量篩選的技術(shù)成為新酶發(fā)現(xiàn)與改造最常用的工具之一[13]。本研究以之前獲得的脯氨酸-3-羥化酶經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后的基因作為研究對象，采用易錯(cuò)PCR技術(shù)進(jìn)行改造，以達(dá)到提高其產(chǎn)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物

重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-ptrp2-H3P菌株由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并于-80 ℃保存，其中P3H基因由多拷貝質(zhì)粒pET21a-P3H攜帶轉(zhuǎn)入宿主菌。

本研究易錯(cuò)PCR引物、定點(diǎn)突變引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成(表1，表2)，引物P1，P2用于從質(zhì)粒pET21a-P3H上擴(kuò)增脯氨酸-3-羥化酶基因，其設(shè)計(jì)原理見參考文獻(xiàn)[14]。

表1 易錯(cuò)PCR引物

表2 定點(diǎn)突變PCR引物

1.1.2 酶和試劑

柱式質(zhì)粒小量提取試劑盒、TaqDNA聚合酶、2×Super pfu Mix (PCR擴(kuò)增酶)、DpnⅠ：購自生工生物工程(上海)股份有限公司；隨機(jī)突變試劑盒：購自Agilent Technologies公司(美國)；其他試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母提取物5，NaCl 10，以去離子水稀釋配制至pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖10，KH2PO42，(NH4)2SO42，NaCl 2，L-脯氨酸5，以去離子水稀釋配制，pH7.5，于115 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 易錯(cuò)PCR (error-prone PCR)隨機(jī)突變[14]

以含P3H基因的重組質(zhì)粒(pET21a-P3H)為模板，利用易錯(cuò)PCR向P3H基因中隨機(jī)引入突變。易錯(cuò)PCR反應(yīng)的上下游引物分別為P1，P2。50 μL易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系包含5 μL 10×易錯(cuò)PCR Buffer、1 μL dNTP Mixture (40 mmol/L)、上下游引物各10 pmol、1 μL GeneMorphП DNA Polymerase (2.5 U/μL)和1 μL pET21a-P3H重組質(zhì)粒模板。通過調(diào)整反應(yīng)體系中質(zhì)粒模板濃度控制隨機(jī)突變的頻率。反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，68 ℃ 1 min，72 ℃ 1 mins，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

以易錯(cuò)PCR產(chǎn)物作為引物及含有目的基因的表達(dá)載體(pET21a-P3H)作為模板進(jìn)行全質(zhì)粒PCR，反應(yīng)體系(50 μL)包含0.5 μL引物、0.5 μL模板質(zhì)粒及25 μL 2×Super pfu Mix。其反應(yīng)條件為68 ℃ 5 min; 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，30個(gè)循環(huán)；延伸10 min。然后，用DpnⅠ內(nèi)切酶在37 ℃反應(yīng)1 h消化帶有Dam酶模板質(zhì)粒(pET21a-P3H)，以保留含有隨機(jī)突變的PCR產(chǎn)物。最后，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，轉(zhuǎn)化后菌液涂布于篩選平板上，37 ℃培養(yǎng)8～12 h至單菌落形成，建立突變文庫。

1.2.2 高產(chǎn)H3P菌株的篩選

將篩選平板上長出的單菌落用經(jīng)滅菌的槍頭挑至裝有300 μL LB培養(yǎng)基的96孔板中，在37 ℃ 220 r/min條件下培養(yǎng)6～7 h后，按4%接種量接種至裝有1.8 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的24孔板中，在30 ℃ 220 r/min培養(yǎng)24 h后用1.2.4方法測定產(chǎn)量。根據(jù)產(chǎn)量篩選出高產(chǎn)菌并分別接種至裝有30 mL LB培養(yǎng)基(含氨芐青霉素50 μg/mL)中，于37 ℃和220 r/min培養(yǎng)8 h后按其體積分?jǐn)?shù)為4%的接種量轉(zhuǎn)接至30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃和220 r/min條件下培養(yǎng)，24 h后取出1 mL菌液于8 000 r/min離心2 min。取上清液用1.2.4方法測H3P含量，并選取H3P產(chǎn)量較高的菌株進(jìn)行測序。

1.2.3 定點(diǎn)突變

以高產(chǎn)菌中含有目的基因的表達(dá)載體(pET21a-P3H)作為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變，引物見1.1.1 反應(yīng)體系(25 μL)包含上下游引物各1 μL、0.5 μL pfu高保真酶、2.5μL pfu Buffer、0.5μL pET21a-P3H高產(chǎn)菌質(zhì)粒模板、0.5 μL dNTP Mixture，用無菌水補(bǔ)足。其反應(yīng)條件為68 ℃ 5 min；94 ℃ 5 mins；94 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 180 s，25個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。然后，用DpnⅠ內(nèi)切酶在37 ℃反應(yīng)1 h消化帶有Dam酶模板質(zhì)粒(pET21a-P3H)。最后，將酶切產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，轉(zhuǎn)化后菌液涂布于篩選平板上，37 ℃培養(yǎng)8～12 h至單菌落形成。

1.2.4 P3H測量方法

(1)在1 mL樣品中加入0.2 mL 0.05 mol/L CuSO4·5H2O、0.5 mL 2.5 mol/L NaOH、0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%H2O2?；靹颉?/p>

(2)加入顯色劑2 mL。稱取10 g 4-(甲氨基)苯甲醛溶于67.5 mL異丙醇中，待溶解后加入32.5 mL高氯酸。

(3)放入70 ℃水浴，加熱3 min。

(4)冷水浴后，在560 nm處測其吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 P3H測量方法的優(yōu)化

目前檢測發(fā)酵液中P3H含量的方法主要有高效液相色譜法和氯胺T法。其中，高效液相色譜法所需儀器昂貴，操作復(fù)雜，不適合推廣，氯胺T法靈敏度低，反應(yīng)時(shí)間較長，且會(huì)與發(fā)酵液中其他物質(zhì)發(fā)生顯色反應(yīng)。針對上述不足，本文創(chuàng)建了一種新的檢測方法，該項(xiàng)目檢測方法取樣量少，檢測時(shí)間短，工藝簡單。并且對實(shí)驗(yàn)檢測方法中加熱溫度、氧化時(shí)間、H2O2濃度和加熱時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化(圖1)。優(yōu)化氧化時(shí)間、H2O2濃度時(shí)，P3H樣品濃度為40 mg/L。優(yōu)化加熱時(shí)間時(shí)，P3H樣品濃度為60 mg/L。當(dāng)H2O2濃度大于1%時(shí)，H3P會(huì)被過度氧化，從而無法正常顯色。從結(jié)果分析得知，最優(yōu)的顯色條件為加入1%H2O2后，在70 ℃水浴加熱3 min。

圖1 各因素對H3P顯色影響Fig.1 Alternative effects of these factors on the colours of H3P

2.2 正向突變體的篩選

2.2.1 模板添加量對突變體的影響

傳統(tǒng)的易錯(cuò)PCR反應(yīng)一般利用保真性較低的普通Taq酶，通過在反應(yīng)體系中添加Mn2+，調(diào)節(jié)dNTP濃度來達(dá)到一定的突變頻率。這種方法重復(fù)性和簡便度不高。本實(shí)驗(yàn)中采用隨機(jī)突變試劑盒進(jìn)行易錯(cuò)PCR反應(yīng)，該方法只需要通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)中質(zhì)粒模板的初始濃度就可以實(shí)現(xiàn)對突變頻率的控制及調(diào)節(jié)。

在隨機(jī)突變過程中，一般認(rèn)為每個(gè)基因中存在1～4個(gè)氨基酸的突變?yōu)檩^為適宜的突變頻率，同時(shí)需要保證具有活性的有效突變體占總數(shù)的70%以上。

為了滿足以上需求，本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)PCR反應(yīng)體系中添加的模板量以調(diào)節(jié)突變頻率。將易錯(cuò)PCR反應(yīng)體系(50 μL)中所添加的模板量分別設(shè)定為10、50、100、200 ng，進(jìn)行易錯(cuò)PCR反應(yīng)及全質(zhì)粒PCR反應(yīng)，在每個(gè)添加量基礎(chǔ)上，挑取10個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序。按照1.2.2中高通量篩選方法進(jìn)行培養(yǎng)?？疾烀總€(gè)模板添加量轉(zhuǎn)化子活性突變體的數(shù)量(表3)。因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇在50 μL體系中加入100 ng模板進(jìn)行易錯(cuò)PCR反應(yīng)。

表3 DNA 模板添加量對隨機(jī)突變庫的影響

2.2.2 高產(chǎn)菌的篩選

按照1.2.1的方法進(jìn)行易錯(cuò)PCR，于50 μL體系中加入100 ng模板質(zhì)粒pET21a-H3P，并對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到大約1 300 bp大小的條帶，說明P3H基因擴(kuò)增成功(圖2)。以此為引物、表達(dá)載體pET21a-H3P為模板，進(jìn)行全質(zhì)粒PCR反應(yīng)，將易錯(cuò)PCR反應(yīng)獲得的突變引入表達(dá)載體。將經(jīng)DpnⅠ消化處理后的PCR產(chǎn)物通過化學(xué)方法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中。37 ℃過夜培養(yǎng)，獲得帶有突變的重組菌轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落使用1.2.2方法進(jìn)行高產(chǎn)菌初篩。利用酶標(biāo)儀測量OD560的數(shù)值。OD560的數(shù)值代表其產(chǎn)量。

圖2 重組大腸桿菌BL21易錯(cuò)PCR的電泳圖Fig.2 Error-prone PCR electrophoresis of recombinant E. coli BL21

于每塊24孔板中，選出1株OD560數(shù)值最大的突變體，使用1.2.2方法復(fù)篩，對復(fù)篩后得到的高產(chǎn)菌進(jìn)行測序，觀察其突變情況。最終，在約1 000個(gè)突變體中篩選得到兩株P(guān)3H高產(chǎn)突變體。將其分別命名為P-2-H3、P-9-D5。突變體的基因突變情況及產(chǎn)量變化如表4所示。2株突變體相對于原菌，產(chǎn)量分別提高了34%和30%。

表4 兩株高產(chǎn)菌突變位點(diǎn)及發(fā)酵產(chǎn)量

2.3 單一突變點(diǎn)的定點(diǎn)突變

對選育出來的2株高產(chǎn)突變體P-2-H3、P-9-D5中的5個(gè)突變點(diǎn)R58C、T83I、H89Y、F109Y、Y119I進(jìn)行單一定點(diǎn)突變，以觀察每個(gè)突變點(diǎn)對P3H產(chǎn)量的影響。根據(jù)測序結(jié)果，利用1.2.3中的方法分別設(shè)計(jì)引物(表2)，分別獲得TBT-R58C、TBT-T83I、TBT-H89Y、TBT-F109Y、TBT-Y119I的單一突變體。測序驗(yàn)證正確后分別發(fā)酵24 h并測其產(chǎn)量。每個(gè)單一突變體P3H產(chǎn)量如表5所示。從中可以看出R58C、T83I、H89Y三個(gè)突變點(diǎn)對P3H的產(chǎn)量有促進(jìn)作用，而F109Y、Y119I這2個(gè)突變點(diǎn)對P3H產(chǎn)量的提升并不明顯或有較小程度下降。因此，將R58C、T83I、H89Y作為優(yōu)勢突變點(diǎn)，進(jìn)一步對其分析。

表5 五株單一突變體發(fā)酵產(chǎn)量

2.4 優(yōu)勢位點(diǎn)疊加突變

對于2株突變體，造成產(chǎn)量提升的主要原因是基因上3個(gè)位點(diǎn)的突變。在TBT-R58C單一突變體的基礎(chǔ)上對另2個(gè)突變位點(diǎn)依次進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到TBT-R58C-T83I、TBT-R58C-T83I-H89Y突變體。發(fā)酵24 h后產(chǎn)量為1 125.3 mg/L，相比原菌提高了53.6%(表6)。由此可知，單一位點(diǎn)突變與疊加突變相結(jié)合的方法可以提高目的基因的表達(dá)效率。

表6 單一突變體與疊加突變體發(fā)酵產(chǎn)量

3 結(jié)論

本文從實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET21a-ptrp2-H3P出發(fā)，在不添加誘導(dǎo)劑IPTG的情況下通過一步法生產(chǎn)P3H。簡化并優(yōu)化了P3H的測量方法并且通過易錯(cuò)PCR方法對脯氨酸-3-羥化酶進(jìn)行定向改造。通過高通量篩選，得到2株高產(chǎn)菌P-2-H3、P-9-D5。2株高產(chǎn)菌經(jīng)測序，共有5個(gè)突變位點(diǎn)，分別對其進(jìn)行定點(diǎn)突變，發(fā)現(xiàn)突變體TBT-R58C、TBT-T83I和TBT-H89Y三株突變體的產(chǎn)量相比與原菌分別提高了21.3%、19.3%和18.6%，由此找出3個(gè)優(yōu)勢位點(diǎn)。之后再對這3個(gè)優(yōu)勢位點(diǎn)進(jìn)行疊加突變，在同一段基因上同時(shí)改變3個(gè)基因位點(diǎn)，得到突變體TBT-R58C- T83I- H89Y。發(fā)酵24 h后其產(chǎn)量達(dá)到了1125.3 mg/L，相比原菌提高了53.6%。由于發(fā)酵時(shí)間短，發(fā)酵液中還有較多底物殘留，所以并未達(dá)到文獻(xiàn)報(bào)到的最高產(chǎn)量，但本株突變體為P3H的工業(yè)化生產(chǎn)提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)。

[1] SURAJIT S,SANTOS H T,SRINIVASAN C.A Convenient synthesis ofcis-3-hydroxy-L-proline[C].Fourth International Electronic Conference on Sythetic Organic Chemistry,2000.

[2] SHIBASAKI T,MORI H,OZAKI A.Cloning of an isozyme of proline 3-hydroxylase and its purification from recombinantEscherichiacoli[J].Biotechnology Letters,2000,22(24):1 967-1 973.

[3] KALAMKAR N B,KASTURE V M,DHAVALE D D.Total synthesis of naturalcis-3-hydroxy-L-proline fromD-glucose[J].Tetrahedron Letters,2010,51(51):6 745-6 747.

[4] LUBEC B,STRNBERG M,MALLINGER R,et al.Cis3 hydroxyproline reduces glomerular basement membranet hickness and collagen type IV synthesis in diabetic rats[J].Animo Acids,1993,4(3):249-254.

[5] DELAUNEY A J,VERMA D P S.Proline biosynthesis and osmoregulation in plants[J].The Plant Journal,1993,4(2):215-223.

[6] YOSHITOMI Y,MAKINO K,HAMADA Y.Organocatalytic synthesis of (2S,3R)-3-hydroxy-3-met hyl-proline(OHMePro),a component of polyoxypeptins,and relatives using OHMePro Itself as a catalyst[J].ORGANIC LETTERS,2007,9(13):2 457-2 460.

[7] MORI H,SHIBASAKI T,UOZAKI Y,et al.Detection of novel proline 3-hydroxylase activities inStreptomycesandBacillusspp.by regio-and stereospecific hydroxylation ofL-proline[J].Applied and Environmental Microbiology,1996,62(6):1 903-1 907.

[8] JOHNSTON R M,CHU L N,LIU M,et al.Hydroxylation ofL-proline tocis-3-hydroxy-L-proline by recombinantEscherichiacoliexpressing a syntheticL-proline-3-hydroxylase gene[J].Enzyme and Microbial Technology,2009,45(6-7):484-490.

[9] JAEGER K E,EGGERT T,EIPPER A,et al. Directed evolution and the creation of enantioselective biocatalysts [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2001,55(5):519-530.

[10] XUE Z,MCCLUSKEY M,CANTERA K,et al.Improved production ofp-hydroxycinnamic acid from tyrosine using a novel thermostable phenylalanine/tyrosine ammonia lyase enzyme [J].Enzyme and Microbial Technology,2007, 42(1):58-64.

[11] CADWELL R C,JOYCE G F.Randomization of genes by PCR mutagenesis [J].Genome Research,1992,2(1):28-33.

[12] KYNDT J A,MEYER T E,CUSANOVICH M A, et al.Characterization of a bacterial tyrosine ammonia lyase,a biosynthetic enzyme for the photoactive yellow protein [J].FEBS Letters,2002,512 (1-3):240-244 .

[13] TAKASE K,TAGUCHI S,DOI Y.Enhanced synthesis of poly(3-hydroxybutyrate) in recombinantEscherichiacoliby means of error-prone PCR mutagenesis,saturation mutagenesis,andinvitrorecombination of the type II polyhydroxyalkanoate synthase gene [J]. Journal of Biochemistry,2003,133(1):139-145.

[14] KENTARO M,MISA T.Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid[J].Biotechniques,2002,33(33):1 033-1 034;1 036-1 038.

The directional modification of proline-3-hydroxylase producingcis-3-hydroxyproline

HUANG Jian-hua, WANG Xiao-jiao, WEI Zhao-hui,ZHANG Zhen-yu*, SUN Fu-bao*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology Ministry of Education,Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology Ministry of Education,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

The proline-3-hydroxylase producingcis-3-hydroxyproline (H3P) with proline as substrate was modified. The recombinant strainE.coliBL21 (DE3)/pET21a-ptrp2-H3P was mutagenized by error-prone PCR. Two mutants P-2-H3, P-9-D5 were selected through high throughput screening method using hole plates coupled with simple color developing method. Five mutation sites were found through gene sequencing and five single mutants TBT-R58C, TBT-T83I, TBT-H89Y, TBT-F109Y, and TBT-Y119I were obtained through site-directed mutagenesis. 3 preferred mutation sites were found based on fermentation of the five single mutants. Based on strain TBT-R58C, the other two sites were site-directed mutated successively to obtain mutant TBT-R58C-T83I-H89Y with yield of 1125.3 mg/L, which increased by 53.6% compared with the original recombinant strain.

recombinantEscherichiacoli; error-prone PCR;cis-3-hydroxyproline (H3P); proline-3-hydroxylase; directed evolution

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701002

碩士研究生(張震宇教授，孫付保副教授為通訊作者,E-mail：1020962150@qq.com，fubaosun@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學(xué)基金(30970058)；國家自然科學(xué)基金(21176106)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK2012554)

2016-05-24，改回日期：2016-08-15