胡 維 梁志林 王良錄 鐘慧玲 劉志剛

(深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳518060)

家蠶過敏原Profilin的表達、純化、免疫學(xué)鑒定及其生物信息學(xué)分析①

胡 維 梁志林 王良錄②鐘慧玲 劉志剛

(深圳大學(xué)過敏反應(yīng)與免疫學(xué)研究所，深圳518060)

目的：克隆表達家蠶(Bombyx mori) Profilin蛋白，鑒定其免疫原性并進行B細胞抗原表位預(yù)測和構(gòu)建分子進化樹。方法：從NCBI上獲取家蠶Profilin蛋白的基因序列，合成該基因并構(gòu)建到pet-28a表達載體上，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21，IPTG誘導(dǎo)基因表達，通過親和層析獲取高純度蛋白；用Western blot方法對重組蛋白進行過敏原性鑒定；通過DNAStar軟件分析其潛在的B細胞抗原表位；應(yīng)用MEGA5.05進行序列比對，并構(gòu)建分子進化樹。結(jié)果：成功表達出重組蛋白，且重組蛋白與家蠶過敏患者血清有一定的IgE結(jié)合。結(jié)論：成功克隆表達出具有免疫原性的Profilin蛋白，并成功預(yù)測出其B細胞抗原表位和構(gòu)建出分子進化樹。

家蠶；Profilin蛋白；過敏原

變態(tài)反應(yīng)疾病已成為當今全球關(guān)注的重要公共衛(wèi)生問題[1]。各國變態(tài)反應(yīng)性疾病的總發(fā)病率為10%～30%[2]。過敏性哮喘是一種很重要的變態(tài)反應(yīng)疾病[3,4]。2010 年9 月,張寅平等[5]在中國10 個重要城市啟動了中國室內(nèi)環(huán)境與兒童健康研究(CCHH)。CCHH調(diào)查發(fā)現(xiàn)中國城市中確診哮喘患病率為1.7%～9.8%(平均為6.8%),相比于1990 年的0.91%有了大幅度增加。養(yǎng)蠶在中國已有5 000年歷史，家蠶的廣泛養(yǎng)殖以及隨之而來的蠶絲用品的大量使用家蠶過敏的報道時有發(fā)生[6,7]。2014年，印度Nagaraj通過比較研究120名繅絲廠與非繅絲廠工人哮喘發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)繅絲廠工人哮喘發(fā)生率為29.16%而非繅絲廠工人哮喘發(fā)生率僅6.6%。用蠶絲、蠶繭或蠶蛹提取液進行皮膚點刺實驗(SPTs)發(fā)現(xiàn)，繅絲廠工人的陽性率為35.83%，遠遠高于非繅絲廠工人的20.83%。該研究在一定程度上說明繅絲廠工人哮喘的發(fā)生與過敏原長期的接觸密切相關(guān)[8]。2001年，哈佛大學(xué)研究人員在中國安慶農(nóng)村對871名兒童做了調(diào)查研究，也發(fā)現(xiàn)對蠶絲過敏的兒童更容易引發(fā)哮喘[9]。然而國內(nèi)外關(guān)于家蠶過敏原蛋白的具體研究以及報道幾乎沒有。本課題組通過功能蛋白組學(xué)的方法分析鑒定出Profilin蛋白為其潛在過敏原(另文報道)。本文主要克隆表達了家蠶Profilin蛋白，通過免疫學(xué)鑒定其過敏原性并通過生物信息學(xué)方法分析其潛在抗原表位，這對于家蠶過敏性疾病的研究提供了進一步的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒載體、表達菌 質(zhì)粒載體Pet-28a購自生工生物工程(上海)股份有限公司(Sangon)，大腸埃希菌BL21(DE3)由深圳大學(xué)過敏與免疫研究所提供。

1.1.2 主要實驗材料 家蠶過敏患者血清取自中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)變態(tài)反應(yīng)科，分裝后-80℃保存。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ購自生工生物工程(上海)股份有限公司。生物素標記的小鼠抗人IgE抗體及HRP標記的鏈霉素親和均購自美國Southern Biotech公司。

1.2 方法

1.2.1 基因合成和克隆載體的構(gòu)建 從NCBI網(wǎng)站上獲得家蠶Profilin蛋白的基因序列，合成該基因并連接至克隆載體pMD18-T。然后將pMD18-T-Profilin陽性質(zhì)粒與原核表達載體pET-28a分別用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切,使Profilin基因片段與pET-28a的酶切產(chǎn)物連接而構(gòu)建出重組表達質(zhì)粒pET-28a-Profilin。最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)E.coli BL21，堿裂解法提取質(zhì)粒后用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切，測序鑒定后用于誘導(dǎo)表達。

1.2.2 家蠶Profilin蛋白的表達純化 取成功轉(zhuǎn)化了重組表達質(zhì)粒pET-28-Profilin的感受態(tài)大腸埃希菌BL21接種于50 ml含卡那的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖菌過夜，待細胞生長至對數(shù)期，將50 ml菌液加至1 L新鮮的LB培養(yǎng)液中200 r/min搖菌至OD600為0.6左右，按體積1∶1 000加入終濃度為1 mol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),150 r/min，低溫25 ℃搖菌20 h，再將表達出來的1 L菌液離心，取沉淀。加入純化用的平衡緩沖液重懸，低溫超聲破碎10 min， 10 000 r/min離心10 min取上清，用0.45 μm膜過濾。將上清液以2 ml/min的流速上樣于以平衡好的鎳-氨三乙酸親和層析柱。然后再用平衡液充分洗柱，再用300 mmol/L含尿素的咪唑平衡緩沖液洗脫目的蛋白并用離心管收集并做好標記。最后SDS-PAGE檢測。

1.2.3 家蠶Profilin蛋白免疫原性分析 將上述純化獲得Profilin的進行SDS-PAGE電泳，經(jīng)半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂奶粉封閉2 h，以家蠶過敏的患者血清為一抗(1∶5稀釋)孵育2 h，TBST洗滌3次，用HRP標記鼠抗人IgE二抗(1∶2 000稀釋)孵育2 h,TBST洗滌3次，用ECL顯示液進行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察、拍照。

1.2.4 家蠶Profilin蛋白的生物信息學(xué)分析 應(yīng)用Blastp和 MEGA5.05進行序列比對，并構(gòu)建分子進化樹。應(yīng)用DNAStar軟件的Protean模塊進行B細胞抗原表位預(yù)測。

2 結(jié)果

2.1 表達載體pET-28a-Profilin的構(gòu)建和酶切鑒定 從NCBI上獲取Profilin的基因序列(登錄號NM_001043643)，合成該基因，再將Profilin基因連接到pET-28a表達載體后，用XhoⅠ和BamHⅠ進行雙酶切鑒定，核酸電泳結(jié)果顯示與Profilin的cDNA長度(381 bp)基本一致(圖1)，證明表達重組質(zhì)粒pET-28a-Profilin構(gòu)建成功。

2.2 家蠶Profilin蛋白的表達和純化 將pET-28a-Profilin重組蛋白表達菌加入1 L新鮮LB液體培養(yǎng)基擴培后，用濃度為1 mol/L的IPTG在25 ℃誘導(dǎo)表達20 h后，采用Ni離子柱親和層析方法初步純化Profilin重組蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳。結(jié)果顯示：分子質(zhì)量約為14 Ku處有外源蛋白條帶出現(xiàn)(圖2)，該條帶與Profilin的理論分子質(zhì)量基本相符。

2.3 家蠶Profilin蛋白免疫原性分析 成功將目的蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)印到PVDF膜后，用22個家蠶過敏患者的血清混合成的血清作為一抗和HRP標記的鼠抗人IgE二抗進行孵育,ECL顯色曝光，結(jié)果顯示：Profilin重組蛋白能與患者血清IgE發(fā)生特異性結(jié)合(圖3)，表明Profilin，具有良好的抗原性。

2.4 家蠶Profilin蛋白的生物信息學(xué)分析

圖1 表達載體pET28a-Profilin酶切鑒定Fig.1 Identification of pET28a-Profilin plasmid digested with restriction enzymeNote: M.DNA marker；1.Digestion of pET28a-Profilin plasmid.

圖2 重組蛋白Profilin表達純化的SDS-PAGE分析Fig.2 Expression and purification of recombinant protein Profilin in silkworm Note: M.Marker;1.Purified protein.

圖3 家蠶Profilin蛋白Western blot結(jié)果圖Fig.3 Western blot analysis of recombinant protein Profilin in silkworm Note: M.Marker;1.Profilin protein.

圖4 Profilin蛋白B細胞抗原表位預(yù)測Fig.4 B cell epitope analysis of protein Profilin in silkworm

圖5 家蠶Profilin蛋白系統(tǒng)進化樹Fig.5 Neighbour joining clustering analysis of Profilin of silkworm

2.4.1 B細胞抗原表位預(yù)測 在蛋白二級結(jié)構(gòu)中，α螺旋、β折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則不易形變，較難嵌合抗體，一般不作為抗原表位，而轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比較松散，利于抗體結(jié)合，符合作為抗原表位。蛋白質(zhì)的柔韌性大的區(qū)域較易發(fā)生扭曲，有利于與抗體的嵌合，為抗原表位可能區(qū)域。蛋白質(zhì)的親水性區(qū)域一般暴露于蛋白的表面，有利于抗體的結(jié)合，因此，這些區(qū)段成為抗原表位的可能性。綜合用Chou-Fasman方法預(yù)測的二級結(jié)構(gòu)、Karplus-schulz方法預(yù)測Profilin蛋白的柔韌性、Kyte-Doolittle方法預(yù)測的親水性和用James-on-Wolf法預(yù)測的抗原指數(shù)，結(jié)果顯示氨基酸序列28～43位為潛在的抗原表位(圖4)。

2.4.2 序列比對及分子進化樹分析 將推導(dǎo)出的家蠶Profilin序列進行Blastp比對分析，篩選出冬尺蠖(Operophtera brumata)、草地夜蛾(Spodoptera frugiperda )、黑脈金斑蝶(Danaus plexippus)、小菜蛾(Plutella xylostella)、Amyelois transitella、柑橘鳳蝶(Papilio xuthus)、玉帶鳳蝶(Papilio polytes)、山雀玉帶鳳蝶(chickadee Papilio polytes)、金鳳蝶(Papilio machaon)等同源序列后以Fsata格式輸出，然后用MEGA5.05軟件構(gòu)建分子進化樹，結(jié)果顯示家蠶Profilin基因與冬尺蠖、草地夜蛾的Profilin基因同源性較近(圖5)。

3 討論

家蠶又稱“桑蠶”。昆蟲綱,鱗翅目,家蠶蛾科。幼蟲灰白色,吃桑葉,蛻皮4次,吐絲做繭,變成蛹,蛹變成蠶蛾。幼蟲吐的絲是重要的紡織原料[10]。養(yǎng)蠶在中國歷史悠久，隨著養(yǎng)蠶業(yè)的發(fā)展及蠶絲制品的廣泛使用，由家蠶引發(fā)的過敏病例時有發(fā)生[11,12]。印度Harindranath[13]曾隨機抽樣調(diào)查兩繅絲廠的243 名工人,發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)生率為36.2% ,而確診為職業(yè)性哮喘者16.9%,居各種職業(yè)性哮喘的發(fā)生率之首。這一發(fā)生率與中國一調(diào)查報告的職業(yè)性哮喘率15.6%相符。在日常生活中主要是由于與絲棉制品接觸而引起呼吸道變態(tài)反應(yīng),臨床表現(xiàn)以哮喘以主,大多數(shù)伴鼻過敏癥狀,少數(shù)病例伴結(jié)膜炎[14]。

中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)對于家蠶過敏原的研究較早，1994王旭東等人通過對3個蠶種場養(yǎng)蠶工人的調(diào)查研究表明，養(yǎng)蠶工人特異性IgE水平與職業(yè)性哮喘發(fā)生呈正相關(guān)。研究人員收集、制備蠶絲、蠶尿、娥尿和娥毛4種變應(yīng)原，用ELISA法測定養(yǎng)蠶工人血清特異性IgE,發(fā)現(xiàn)蠶尿特異性IgE的陽性率明顯高于其他的3種變應(yīng)原[15]。2006年深圳大學(xué)的研究人員對家蠶過敏原tropomyosin基因進行克隆表達,并通過Western blot方法成功鑒定了其免疫原性。本實驗從NCBI數(shù)據(jù)庫上獲取家蠶Profilin基因序列，通過化學(xué)合成該基因，將其目的基因連接到pET28載體構(gòu)建其表達載體，最后成功將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌。通過小量表達摸索出Profilin的表達條件，按小量表達條件大量表達該蛋白，最后通過鎳親和層析成功獲得高純度的Profilin蛋白。用22份家蠶過敏原混合血清與重組蛋白Profilin孵育進行Western blot實驗，結(jié)果表明：重組的Profilin蛋白能和家蠶過敏患者血清中的IgE結(jié)合，說明重組的過敏原具有免疫原性。本實驗進一步通過生物信息學(xué)的方法預(yù)測其B細胞潛在抗原表位，為家蠶過敏反應(yīng)性疾病的特異性診斷和疫苗免疫治療奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

致謝：衷心感謝中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)變態(tài)反應(yīng)科提供家蠶患者陽性血清，為本實驗的順利進行提供了條件。

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[收稿2016-02-27 修回2016-04-18]

(編輯 張曉舟)

Expression,purification and bioimformatics analysis of allergen protein Profilin from silkworm (Bombyx mori)

HUWei，LIANGZhi-Lin，WANGLiang-Lu，ZHONGHui-Ling，LIUZhi-Gang.

InstitueofAllgeryandImmunology,SchoolofMedicineofShenzhenUniversity,Shenzhen518060,China

Objective:To obtain recombinant Profilin of silkworm,identify its immunogenicity,predict its B cell epitopes and construct the evolutionary trees.Methods: The nucleotide sequence of Profilin was acquired from NCBI,synthesized it and cloned it into pET-28 vector.Then,the recombinant plasimids were transformed to E.coli BL21.After induced by IPTG,recombinant protein was purified by Affinity chromatography.Furtherly,its allergenicity was identified by Western blot,the potential B cell epitopes was analyzed through DNAStar and build the evolutionary trees by MEGA5.05.Results: The recombinant protein of Profilin was successfully expressed and purified by affinity chromatography.Besides,the protein contains a high IgE-binding activity with IgE existing in serum of patients allergic to silkworm.Conclusion: The recombinant proflilin has IgE-binding activity,and it is meaningful for fundamental research and specific diagnosis studies of allergic diseases caused by silkworm.

Silkworm;Profilin protein;Allergen

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.016

①本文為國家衛(wèi)生部公益性行業(yè)科研專項(No.2015SQ00136)、廣東省工程技術(shù)研究開發(fā)中心項目(No. 2013158925)、廣東省對外科技合作項目(No.2013B051000088)和深圳市科技計劃基礎(chǔ)研究項目(No.JCYJ20140828163633991、JCYJ20140418095735604)。

胡 維(1991年-)，男，碩士，主要從事過敏原分子生物學(xué)研究。

及指導(dǎo)教師：劉志剛(1959年-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事過敏與免疫學(xué)研究，E-mail:lzg@szu.edu.cn。

R392.8

A

1000-484X(2017)01-0081-04

②北京協(xié)和醫(yī)院變態(tài)反應(yīng)科，北京100730。