李文梅 游顏杰 苑 藝 劉佳佳 高鳳蘭

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，河南 漯河 462000)

唑來(lái)膦酸對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730的放射增敏效應(yīng)

李文梅 游顏杰 苑 藝 劉佳佳 高鳳蘭

(漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系，河南 漯河 462000)

目的 觀察唑來(lái)膦酸(ZOL)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730放射敏感性的影響。方法 血管內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730經(jīng)ZOL處理后，噻唑藍(lán)比色法檢測(cè)細(xì)胞活性，克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞放射敏感性，小管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞血管形成能力，侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。結(jié)果 ZOL處理呈劑量依賴(lài)性抑制CRL-1730細(xì)胞增殖能力；ZOL與電離輻射聯(lián)用對(duì)CRL-1730細(xì)胞有明顯的增敏效應(yīng)，可抑制CRL-1730細(xì)胞克隆形成、小管形成及侵襲能力，同單純ZOL用藥組及單純放射組比較差異顯著(P<0.05)。結(jié)論 ZOL處理可有效提高血管內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730的放療敏感性。

唑來(lái)膦酸；血管內(nèi)皮細(xì)胞；細(xì)胞增殖；放射敏感性

放射治療是惡性腫瘤重要治療手段之一。腫瘤血管形成是腫瘤獲得生長(zhǎng)需要的養(yǎng)分及發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要條件，增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性可以提高放療效果〔1〕。唑來(lái)膦酸(ZOL)不僅直接抑制腫瘤細(xì)胞的增殖分化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力，還可以抑制腫瘤新生血管形成〔2～6〕。ZOL對(duì)于電離輻射(IR)對(duì)惡性腫瘤的殺傷效應(yīng)具有增敏作用，然而其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用尚不明確〔7～9〕。本實(shí)驗(yàn)觀察ZOL對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及細(xì)胞 ZOL注射液購(gòu)自購(gòu)自瑞士諾華公司；達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)液(DMEM)和胎牛血清(FBS)均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Matrigel購(gòu)自美國(guó)BD公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；其他常規(guī)化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。細(xì)胞培養(yǎng) 人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 噻唑藍(lán)(MTT)比色法 細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，設(shè)4個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h；更換含有不同濃度(0～64 μmol/L)ZOL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入20 μl MTT(5 mg/ml)作用4 h；棄去培養(yǎng)液加入150 μl DMSO，振蕩10 min，測(cè)定各孔490nm吸光度值(A490)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。

1.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞以含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基配成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104/ml，分別以不同細(xì)胞數(shù)(100、200、500、1 000、4 000)接種至6孔板中，培養(yǎng)24 h后，更換含8 μmol/L ZOL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)6 h，室溫下以直線(xiàn)加速器6 MV X線(xiàn)照射(機(jī)架角180°，照射距離100 cm，劑量1 Gy/min)，分別照射0、1、2、4、6 Gy 后更換不含藥物的培養(yǎng)液，與單純放射組一起繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，甲醇固定，姬姆薩染色，計(jì)數(shù)>50細(xì)胞克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率〔(克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%〕。以對(duì)照組為100%計(jì)算存活分?jǐn)?shù)(SF)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果經(jīng)單純ZOL處理組實(shí)驗(yàn)結(jié)果校正細(xì)胞毒性。

1.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L ZOL處理6 h后接受4 Gy劑量放射，以無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×106ml，于每個(gè)的Transwell上室內(nèi)加入100 μl；將整個(gè)Transwell小室放入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液的24孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h；上室甲醇固定，結(jié)晶紫染色，擦掉位于上室面未穿膜細(xì)胞后封片，光鏡下計(jì)數(shù)5個(gè)200倍視野的遷移細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)設(shè)未處理對(duì)照組、單純ZOL用藥組(ZOL組)、單純放射組(IR組)與ZOL聯(lián)合放射處理組(ZOL+IR組)。

1.5 小管形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L ZOL處理6 h后接受4 Gy劑量放射，以5×103/孔接種于預(yù)先鋪有Matrigel的96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后光鏡下觀察小管形成情況并計(jì)數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 ZOL抑制CRL-1730細(xì)胞增殖能力 經(jīng)不同濃度(2、4、8、16、32、64 μmol/L)ZOL處理72 h后，其增殖能力A490值分別為1.156±0.077、1.076±0.057、0.901±0.039、0.787±0.041、0.724±0.051、0.684±0.037，相對(duì)于對(duì)照組(1.386±0.055)顯著降低，抑制效應(yīng)呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。

2.2 ZOL增強(qiáng)CRL-1730細(xì)胞放射敏感性 克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CRL-1730細(xì)胞經(jīng)4 μmol/L ZOL處理后，在不同的4 Gy與6 Gy照射劑量下，均可顯著降低細(xì)胞的SF，提示ZOL預(yù)處理可增強(qiáng)電離輻射對(duì)CRL-1730細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。見(jiàn)表1。

2.3 ZOL聯(lián)合放射處理對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 與對(duì)照組(215.7±17.1)相比，ZOL組侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少(155.0±12.5，P<0.05)，IR組未見(jiàn)明顯改變(197.4±21.7，P>0.05)。ZOL+IR組(74.6±23.5)與對(duì)照組、ZOL組或IR組相比，細(xì)胞侵襲能力均顯著降低(P<0.05)。

2.4 ZOL聯(lián)合放射處理對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞小管形成能力的影響 ZOL組(16.8±2.3)或IR組(19.1±1.5)小管形成能力較對(duì)照組明顯減弱(23.6±2.5，P<0.05)。ZOL+IR組(9.6±3.1)與對(duì)照組、ZOL組或IR相比，小管形成數(shù)目均顯著減少,且管腔更不完整(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

表1 ZOL處理對(duì)CRL-1730細(xì)胞SF的影響

與0 Gy組比較：1)P<0.05

圖1 ZOL聯(lián)合放射抑制CRL-1730細(xì)胞小管形成(×200)

3 討 論

ZOL是目前抗骨吸收最強(qiáng)的雙磷鹽類(lèi)藥物，臨床上主要應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松、骨更新代謝異常加快以及惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移引起的骨痛癥和高鈣血癥等疾病。研究顯示ZOL具有直接的抗腫瘤作用，一方面可以通過(guò)干擾諸如Ras、Rho和Rac等小分子結(jié)合蛋白的翻譯后修飾從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，另一方面可以活化γ/δT細(xì)胞增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)〔4～9〕。本研究中發(fā)現(xiàn)ZOL可以呈劑量依賴(lài)性抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞CRL-1730的增殖能力。在此基礎(chǔ)上，為了避免高濃度藥物的細(xì)胞毒作用對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，本研究選擇較低藥物濃度(4 μmol/L)。低濃度ZOL作用于腫瘤細(xì)胞系導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在S期并伴隨細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)降低，尤其是cyclinE和cyclinD1的明顯改變，從而阻滯DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展〔7～9〕。腫瘤血管形成是腫瘤獲得生長(zhǎng)需要的養(yǎng)分及發(fā)生轉(zhuǎn)移的必要條件，而ZOL是否對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的具有放射增敏效應(yīng)目前尚不明確。已知干擾血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性〔10，11〕。本研究提示ZOL可作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的放療增敏劑。低濃度ZOL處理可減弱CRL-1730細(xì)胞侵襲和小管形成能力，這種抑制效應(yīng)在ZOL聯(lián)合電離輻射處理時(shí)更為顯著。

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〔2015-06-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(142102310464)；漯河醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校自然科學(xué)項(xiàng)目(2016-S-LMC10)

高鳳蘭(1966-)，女，教授，主要從事腫瘤病理學(xué)研究。

李文梅(1985-)，女，助教，主要從事醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)研究。

R73

A

1005-9202(2017)02-0278-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.02.008