陳 誠 游雪云 付子毅

(撫州市婦幼保健院，江西 撫州 344000)

miR-26b在卵巢癌組織中的表達與功能

陳 誠 游雪云1付子毅2

(撫州市婦幼保健院，江西 撫州 344000)

目的 探討microRNA-26b(miR-26b)在卵巢癌組織中的表達情況，并探討其對卵巢癌細胞株HO8910惡性行為的影響。方法 采用實時定量PCR(qPCR)檢測72例卵巢癌患者經(jīng)手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織標本(卵巢癌組)中的miR-26b水平，同時選取26例正常卵巢上皮組織(正常組)和45例良性卵巢上皮囊腫組織(良性組)作對照，分析miR-26b表達與臨床病理參數(shù)(年齡、臨床分期、分化程度、組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。將化學合成miR-26b前體分子 mimics 和無關(guān)序列轉(zhuǎn)染卵巢癌細胞株HO8910，采用MTT法檢測轉(zhuǎn)染 24、48、72、96 h后的細胞增殖情況，采用流式細胞儀PI/Annexin V-FITC雙染法及PI單染法檢測轉(zhuǎn)染48 h后的細胞凋亡及細胞周期情況。結(jié)果 卵巢癌組的miR-26b水平均低于正常組和良性組(P<0.05)，且其表達與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)。與對照組相比，過表達組(轉(zhuǎn)染miR-26b mimics)的增殖抑制率和凋亡率均升高，且細胞周期中G0/G1期細胞比例升高而S期細胞比例降低(P<0.05)。結(jié)論 在卵巢癌細胞中上調(diào)miR-26b表達可抑制增殖并誘導凋亡及細胞周期組織，在卵巢癌防治中有一定價值。

卵巢癌；miR-26b

卵巢癌是一種惡性程度較高的婦科腫瘤，發(fā)病隱匿且缺乏有效篩查手段，確診時多為晚期，無法行手術(shù)治療，而常規(guī)治療手段效果不理想〔1〕。深入研究卵巢癌的發(fā)病機制和致病基因是目前的當務(wù)之急〔2〕。microRNA是一種可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的保守非編碼RNA,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及惡性轉(zhuǎn)化關(guān)系密切。microRNA-26b(miR-26b)可抑制腫瘤細胞的增殖，且在肝癌、胃癌和乳腺癌組織及細胞中表達下調(diào)〔3～5〕，但目前在卵巢癌中的功能尚不清楚。本研究擬首先在卵巢癌組織中觀察miR-26b的表達，然后通過轉(zhuǎn)染手段觀察過表達其水平對卵巢癌細胞增殖、凋亡及細胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株及試劑 人卵巢癌細胞株HO8910購自上海中科院生化細胞所，置于含10%胎牛血清的RPMI1640中常規(guī)條件培養(yǎng)。RNA抽提試劑盒Trizol、脂質(zhì)體試劑Lipofectamine 2000TM購自Invitrogen公司， SYBR qPCR Mix及ROX校正染料購自Fermentas 公司，miR-26b 前體分子 mimics(5′-UGGAUAGGACUUAAUGAACUU-3′)和無關(guān)序列(5′-GGCUGACAGCCUUAUCAG-3′)購自美國Applied Biosystems公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購于美國Millipore公司，噻唑藍(MTT)購自Sigma公司，膜聯(lián)蛋白 V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細胞凋亡雙染試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 組織樣本 收集2013年1月至2015年12月江西省婦幼保健院病理科存檔的72例卵巢癌患者手術(shù)切除的上皮性卵巢癌組織標本(卵巢癌組)，均經(jīng)病理確診且取樣前未行放化療，年齡31～64歲，中位年齡52.5歲，≤50歲29例，>50歲43例；臨床分期：Ⅰ期15例，Ⅱ期19例，Ⅲ期21例，Ⅳ期17例；組織學類型：漿液性36例，黏液性16例，內(nèi)膜樣13例，透明細胞7例；分化程度：低分化28例，中分化25例，高分化19例；47例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。選取26例正常卵巢上皮組織(正常組)和45例良性卵巢上皮囊腫組織(良性組)作對照，其中正常組取材于子宮肌瘤或子宮腺肌癥等手術(shù)同時行附件切除術(shù)的卵巢，年齡范圍30～63歲，中位年齡53.0歲；良性組的年齡范圍33～68歲，中位年齡55.0歲。3組年齡均無統(tǒng)計學差異，具可比性。

1.3 實時定量PCR(qPCR) 將液氮凍存的癌組織及癌旁組織標本，采用TRIzol法提取總RNA，選取符合擴增要求的RNA(OD260/OD280介于1.8～2.0)。

每份RNA樣品均取2 μg在M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，以cDNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，總體系為20 μl，反應(yīng)條件為95℃預變性10 min，后按95℃ 15 s，60℃ 1 min，共40個循環(huán)。采用Primer 5.0 軟件設(shè)計熒光定量PCR引物，其中miR-26b上游：5′-CAAAGGTCCATAGCAAGGGT-3′； 下游：5′-GCGACCTTGTCATGGTTTATAG-3′；內(nèi)參U6上游：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′； 下游：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。應(yīng)用2-△△Ct法計算卵巢癌組和良性組相對于正常組的miR-26b表達量。分析miR-26b表達與卵巢癌臨床病理參數(shù)(年齡、臨床分期、分化程度、組織類型及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移)的關(guān)系。

1.4 細胞分組及轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期HO8910細胞分為對照組、空轉(zhuǎn)染組和過表達組，對照組不行轉(zhuǎn)染處理；過表達組通過脂質(zhì)體Lipofectamine 2000包裹miR-26b mimics后瞬時轉(zhuǎn)染HO8910細胞；空轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，轉(zhuǎn)染24 h后采用qPCR法檢測各組細胞的miR-26b以驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.5 細胞增殖檢測 取對數(shù)生長期HO8910細胞，以1×104細胞/孔接種于無菌96孔培養(yǎng)板，分組同上，每組設(shè)5個復孔，分別取轉(zhuǎn)染24、48、72、96 h后4個時間點，采用微量移液器向每孔各加入20 μl MTT溶液(5 g/L)，孵育4 h后吸取孔內(nèi)上清，每孔加入DMSO 150 μl，搖床上震蕩10 min后在ELX800型自動酶標儀490 nm波長測各組吸光值(A)，根據(jù)公式計算實驗組相對于對照組的增殖抑制率：增殖抑制率= (1-實驗組A值/對照組A值)×100。

1.6 流式細胞儀PI/Annexin V雙染法 收集轉(zhuǎn)染后的各組細胞，按1×105個/ml的密度接種培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)染24、48 h后取100 μl細胞置于流式管中，加入Annexin V-FITC 10 μl和PI 5 μl溶液，避光孵育15 min后FACSCalibur 流式細胞儀檢測10 000個細胞的凋亡情況。實驗重復3次。

1.7 細胞周期檢測 收集各組轉(zhuǎn)染96 h的HO8910細胞，用胰蛋白酶消化細胞，經(jīng)PBS清洗后用預冷乙醇固定2 h以上，PBS清洗后加入RNase A處理30 min，加入20 g/ml PI溶液，避光反應(yīng)30 min后上流式細胞儀檢測各周期細胞分布。

1.8 統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件。計量資料兩組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 miR-26b在卵巢癌組織中的表達情況 卵巢癌組miR-26b水平(0.247±0.011)低于正常組(1.014±0.009)和良性組(1.102±0.026)(P<0.05)；正常組和良性組miR-26b水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 miR-26b水平與卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 卵巢癌組織中，miR-26b水平與年齡(≤50歲組：0.254±0.019，>50歲組0.242±0.023)及組織學類型(漿液性0.249±0.022，其他：0.245±0.019)均無關(guān)(P>0.05)，但與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)(P<0.05)，其中Ⅲ+Ⅳ期(0.154±0.017)、低分化(0.133±2.021)及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(0.186±0.012)的miR-26b水平均低于相應(yīng)項(Ⅰ+Ⅱ期：0.351±0.045；高+中分化：0.288±0.027；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.361±0.031)(P<0.05)。

2.3 HO8910細胞過表達后的miR-26b水平 過表達組轉(zhuǎn)染96 h后的miR-26b水平(6.114±0.472)高于對照組(1.057±0.024)(P<0.05)，提示在HO8910細胞中成功過表達miR-26b；空轉(zhuǎn)染組的miR-26b水平為(0.991±0.032)，與對照組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 過表達miR-26b對HO8910細胞增殖水平的影響 過表達組轉(zhuǎn)染24～96 h的增殖抑制率均高于其余兩組(P<0.05)，其中96 h細胞基本死亡；其余兩組增殖抑制率無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

2.5 過表達miR-26b對HO8910細胞凋亡水平的影響 對照組和空轉(zhuǎn)染組的凋亡率分別為(5.54±0.39)%和(6.13±0.57)%，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；過表達組的凋亡率為(33.29±2.64)%，高于其余兩組(P<0.05)。

2.6 過表達miR-26b對HO8910細胞周期水平的影響 與其余兩組相比，過表達組細胞周期中G0/G1期細胞比例升高而S期細胞比例降低(P<0.05)；對照組和空轉(zhuǎn)染組細胞周期比例無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表2。

組別24h48h72h96h對照組0000空轉(zhuǎn)染組0.75±0.091.12±0.130.98±0.200.85±0.17過表達組15.49±1.571)2)42.56±2.821)2)72.19±3.651)2)96.19±3.111)2)

與對照組比較:1)P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較:2)P<0.05；下表同

組別G0/G1SG2/M對照組45.61±2.7537.28±2.6219.13±1.35空轉(zhuǎn)染組47.33±2.9236.95±3.1920.48±1.76過表達組71.42±3.401)2)18.19±1.781)2)21.67±2.121)2)

3 討 論

miRNAs在腫瘤調(diào)控中主要以癌基因或抑癌基因的形式發(fā)揮作用，但miRNA對腫瘤的調(diào)控模式研究仍處于初步階段〔6,7〕。針對卵巢癌發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用的miRNA進行研究有重要臨床價值。miR-26b在多種腫瘤組織中異常表達，且在不同腫瘤中扮演著癌基因或抑癌基因的角色〔8,9〕，提示miR-26b具有腫瘤特異性。本研究提示miR-26b在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因的作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b水平與臨床分期、分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，其中腫瘤惡性程度越高時(如臨床分期越晚、分化程度越低)miR-26b水平越低，以上結(jié)果表明miR-26b在卵巢癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，推測miR-26b水平降低可能與其表達受抑制有關(guān)。

為進一步驗證miR-26b的功能，本研究選取常見的HO8910細胞通過轉(zhuǎn)染前體mimics，在轉(zhuǎn)染24 h后即可發(fā)現(xiàn)miR-26b水平大幅升高，表明HO8910細胞成功過表達miR-26b，具有較好的方法學基礎(chǔ)。過表達miR-26b后HO8910細胞的增殖抑制率升高，表明過表達miR-26b可抑制HO8910細胞增殖，此外過表達miR-26b可誘導細胞凋亡及細胞周期G0/G1期阻滯，更好地說明miR-26b具有抑癌基因的效果。miR-26b可抑制卵巢癌細胞的惡性行為可能與其調(diào)控的靶基因有關(guān)，如馬德亮等〔10〕的研究發(fā)現(xiàn)miR-26b可靶向抑制Wnt信號通路中糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)的表達，負性參與乳腺癌細胞的干性調(diào)節(jié)，而葉勁軍等〔11〕發(fā)現(xiàn)miR-26b能與MDM2 3′UTR 特異結(jié)合，并調(diào)控P53/MDM2通路影響胃癌細胞的增殖及凋亡。

1 任立新,王亞帝.紫杉醇聯(lián)合洛鉑或順鉑治療晚期老年卵巢癌的療效和安全性〔J〕.中國老年學雜志,2013;33(10):2284-6.

2 韋佩佳.老年復發(fā)卵巢癌患者預后影響因素〔J〕.中國老年學雜志,2014;34(8):2081-2.

3 Lu J,He ML,Wang L,etal.MiR-26a inhibits cell growth and tumorigenesis of nasopharyngeal carcinoma through repression of EZH2 〔J〕.Cancer Res,2011;71(1):225-33.

4 Deng M,Tang HL,Lu XH,etal.miR-26a suppresses tumor growth and metastasis by targeting FGF9 in gastric cancer 〔J〕.PLoS One,2013;8(8):e72662.

5 Gaedcke J,Grade M,Camps J,etal.The rectal cancer microRNAome-microRNA expression in rectal cancer and matched normal mucosa〔J〕.Clin Cancer Res,2012;18(18):4919-30.

6 Li Y,Li Y,Liu J,etal.Expression levels of microRNA-145 and microRNA-10b are associated with metastasis in non-small cell lung cancer 〔J〕.Cancer Biol Ther,2016;17(3):272-9.

7 Simmer F,Venderbosch S,Dijkstra JR,etal.MicroRNA-143 is a putative predictive factor for the response to fluoropyrimidine-based chemotherapy in patients with metastatic colorectal cancer 〔J〕.Oncotarget,2015;6(26):22996-3007.

8 Palumbo T,Faucz FR,Azevedo M,etal.Functional screen analysis reveals miR-26b and miR-128 as central regulators of pituitary somatomammotrophic tumor growth through activation of the PTEN-AKT pathway 〔J〕.Oncogene,2013;32(13):1651-9.

9 Liu XX,Li XJ,Zhang B,etal.MicroRNA-26b is underexpressed in human breast cancer and induces cell apoptosis by targeting SLC7A11〔J〕.FEBS Lett,2011;585(9):1363-7.

10 馬德亮,秦 靜,張佃富,等.miR-26b靶向GSK-3β發(fā)揮抗乳腺癌細胞干性的作用研究〔J〕.臨床腫瘤學雜志,2015;20(12):1068-73.

11 葉勁軍,周國仁,張 治,等.miR-26a/b調(diào)控p53/MDM2通路對胃癌細胞凋亡的影響〔J〕.臨床腫瘤學雜志,2015;20(11):972-6.

〔2016-04-15修回〕

(編輯 徐 杰)

國家自然科學基金(81302304)

陳 誠(1975-)，男，副主任技師，主要從事臨床檢驗研究。

R739

A

1005-9202(2017)01-0015-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.006

1 江西省婦幼保健院 2 南京醫(yī)科大學附屬南京市婦幼保健院醫(yī)學研究中心