王會敏 梁 玉

(天津醫(yī)科大學組織胚胎學教研室，天津 300070)

羅格列酮對OLETF大鼠肝臟組織病理變化及白細胞介素-17、Bcl-xl表達的影響

王會敏 梁 玉

(天津醫(yī)科大學組織胚胎學教研室，天津 300070)

目的 探討羅格列酮(RGZ)對2型糖尿病(T2DM)OLETF大鼠肝臟組織病理變化及白細胞介素(IL)-17、Bcl-xl的影響。 方法 取OLETF雄性T2DM大鼠16只，隨機分為T2DM組和RGZ組，正常對照組(NC)組為LETO鼠，每組8只。給藥12 w后同時采集肝臟組織，進行HE、Mass、PAS染色觀察組織學改變，免疫組織化學染色觀察IL-17和Bcl-xl陽性細胞。結(jié)果 T2DM組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，可見大量膠原纖維。肝細胞脂肪空泡形成、糖原沉積減少、細胞凋亡增加，Bcl-xl蛋白表達降低、炎癥因子IL-17增加。RGZ組較T2DM組肝細胞損傷明顯減輕。結(jié)論 T2DM可致肝臟組織學發(fā)生損傷，而羅格列酮可減輕這種損傷的發(fā)生。

2型糖尿?。桓闻K；羅格列酮；Bcl-xl；白細胞介素-17

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，屬Ⅱ型核受體超家族成員，在參與調(diào)節(jié)細胞生長、分化及脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮重要作用。羅格列酮(RGZ)是一種噻唑烷二酮類藥物，它通過激活PPARγ而增強胰島素的敏感性，還能糾正代謝綜合征，抗氧化應激，抗炎癥反應。相比較于二甲雙胍等抗2型糖尿病羅格列酮藥物，使得心臟病的發(fā)作風險增加，但吡格列酮沒有〔1〕。Zhi等〔2〕RGZ研究結(jié)果顯示RGZ治療與女性骨折風險呈正相關(guān)，且與年齡無關(guān)，但與其使用時間長短的關(guān)系不太確定。本實驗通過研究自發(fā)性T2DM OLETF大鼠及其同系非糖尿病LETO鼠，通過一系列組織形態(tài)學的觀察以及免疫組織化學染色炎癥因子白細胞介素(IL)-17和抗細胞凋亡抗體Bcl-xl的變化來觀察糖尿病肝臟的改變，探討RGZ對T2DM OLETF大鼠肝臟損害的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 引進日本大冢制藥株式會社德島研究所24只OLETF鼠及8只同系非糖尿病LETO對照鼠作為研究對象，皆為雄性鼠，4周齡，建立T2DM模型。OLETF大鼠較LETO肥胖、活動遲緩、懶動、精神萎靡、少動閉眼、弓背蜷縮、喜扎堆、畏寒喜暖、毛色干枯無光澤。

1.2 試劑與儀器 馬來酸羅格列酮為葛蘭素史克(天津)有限公司生產(chǎn)，批號為08030115。抗IL-17、Bcl-xl單克隆抗體為Santa Cruz公司生產(chǎn)，SP免疫組化試劑盒由美國ZYMED公司提供。熒光分析系統(tǒng)購自美國Promega公司。膠原蛋白標準品和羥脯氨酸標準品由Sigma公司生產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 T2DM大鼠模型建立及分組 大鼠在無特定病原體(SPF)級條件下單籠飼養(yǎng)，飼以標準飼料，12/12 h光照黑暗循環(huán)，自由獲取食物和飲水。定期行口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)檢測血糖，按2 g/kg予30%葡萄糖溶液灌胃，于空腹及糖負荷后30、60、90和120 min取血，以德國內(nèi)卡BIOSEN5030快速葡萄糖分析儀測定血。糖值以血糖峰值>16.7 mmol/L和負荷后120 min血糖>11.1mmol/L診為糖尿病，只具備上述1條件為糖耐量減低。至30 w時，共有成模OLETF大鼠16只，隨機分為T2DM對照(T2DM)組、RGZ組(每組8只)，LETO為正常(NC)組。RGZ組：羅格列酮以蒸餾水溶解稀釋，給藥劑量為3 mg·kg-1·d-1。T2DM組與NC組以等量蒸餾水灌胃，各組均灌胃給藥12 w，1次/d。

1.3.2 標本采集 三組大鼠同時處死，分別取肝臟組織。動物于股動脈放血后脫頸處死。以無菌器械迅速取肝臟2塊，1塊放入DEPC處理過的凍存管中，丟入液氮保存?zhèn)溆茫?塊置于10%的福爾馬林中，行石蠟包埋切片。

1.4 觀察指標

1.4.1 肝臟組織學觀察 將石蠟標本制成5 μm的切片，HE染色后對肝臟的結(jié)構(gòu)進行組織學觀察。

1.4.2 膠原纖維的觀察 石蠟標本制成切片后，進行Masson三色染色，觀察各組膠原纖維的變化。

1.4.3 羥脯氨酸法測膠原蛋白 用高效液相色譜儀，測定膠原中的羥脯氨酸。以羥脯氨酸標準品的質(zhì)量濃度X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，根據(jù)羥脯氨酸標準曲線求得膠原蛋白標準品中羥脯氨酸含量，之后測定每個樣品中羥脯氨酸的含量，進而換算出每個樣本膠原蛋白含量。

1.4.4 肝糖原的觀察 石蠟標本制成切片后，進行過碘酸-雪夫(PAS)染色，觀察各組肝糖原的累積。

1.4.5 肝臟組織IL-17的測定 利用抗IL-17單克隆抗體，按SP法進行免疫組化染色，步驟：①切片常規(guī)脫蠟入水；②3%過氧化氫滅火內(nèi)源性酶；③熱誘導修復抗原；④滴加血清封閉液；⑤加入一抗(1∶125)，4℃冰箱過夜；⑥加二抗37℃ 15 min；⑦滴加試劑S-A/HRP 37℃15 min；⑧滴加試劑DAB顯色，水洗；⑨二甲苯透明，封片。以胞質(zhì)和細胞外基質(zhì)中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達，以PBS代替一抗作為陰性對照。采用Motic Imgages Advanced3.2版圖像分析軟件觀察和分析IL-17的陽性表達水平。

1.4.6 肝臟組織Bcl-xl的測定 步驟同上。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色光鏡下不同組肝臟組織學觀察 NC組大鼠肝小葉規(guī)則，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀整齊排列，肝細胞分界清，細胞中央有大而圓的核，細胞質(zhì)均勻，無炎性細胞浸潤。T2DM組可見肝細胞排列結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞腫脹、體積較正常增大，細胞內(nèi)有較多空泡形成，考慮為脂肪變性，嚴重者胞質(zhì)疏松，呈漁網(wǎng)樣改變，且存在小葉內(nèi)與門管區(qū)較多炎性細胞浸潤。RGZ組肝細胞結(jié)構(gòu)尚清晰，肝索結(jié)構(gòu)排列尚整齊，雖然也存在空泡和炎性細胞，但較T2DM組明顯減少。

2.2 肝臟組織Masson染色觀察 NC組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊，藍色著色偶見于管壁，僅極少量膠原組織沉積于中央靜脈壁；T2DM組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，門管區(qū)膠原大量沉積，可見大量膠原纖維自中央靜脈及門管區(qū)向周圍延伸，RGZ組肝細胞的體積較糖尿病組減小，胞質(zhì)內(nèi)脂滴的數(shù)目明顯減少，甚至消失，炎細胞明顯減少，形成纖維間隔。見圖1。

圖1 各組肝臟Masson染色(×400)

2.3 羥脯氨酸測量膠原蛋白含量 高效液相色譜法測得每克肝臟組織中的膠原蛋白含量T2DM組〔(134.54±18.78)mg/g〕明顯高于NC組〔(64.52±21.51)mg/g，P<0.01〕。RGZ組〔(91.59±10.75)mg/g〕低于T2DM組(P<0.01)。

2.4 肝臟PAS染色觀察 NC組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞分界清晰，肝糖原分布均勻密集，染色均一呈粉紅色，定位于胞質(zhì)。T2DM組可見大量的脂肪空泡，肝細胞腫脹，擁擠且肝糖原分布疏松，呈漁網(wǎng)狀。RGZ組肝糖原較T2DM組密布，脂肪空泡減少。見圖2。

2.5 肝臟組織IL-17測定 肝臟IL-17免疫組化染色結(jié)果與T2DM組表達水平(32.06±3.21)較NC組IL-17著色較少〔(1.79±0.45)，(P<0.01)〕，主要分布在肝血竇，偶有在肝細胞內(nèi)可見。而T2DM組IL-17呈彌漫性著色，且著色較深。RGZ組(7.35±1.47)著色較T2DM組明顯減少(P<0.01)，在部分肝細胞著色較多。見圖3。

2.6 肝臟組織Bcl-xl免疫組化圖像結(jié)果分析 肝臟組織Bcl-xl在T2DM組(24.19±4.41)陽性表達較NC組(61.63±6.46)明顯降低(P<0.01)。Bcl-xl陽性染色在NC組肝臟分布較均勻，密致，以中央靜脈為中心向周圍發(fā)射狀分布，在肝小葉間隙處較少，可能與血供有關(guān)。T2DM組分布較凌亂，可見大量的脂肪空泡，核固縮壞死細胞，Bcl-xl在脂肪空泡周圍分布密集。RGZ組(36.91±4.82)較T2DM組稍有好轉(zhuǎn)(P<0.01)，脂肪空泡減少，但其著色較NC組明顯減少(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組肝臟Bcl-xl表達(DAB，×400)

3 討 論

有研究表明血糖含量高的小鼠肝臟載脂蛋白(APOM)水平明顯降低，在細胞培養(yǎng)中高濃度的葡萄糖抑制APOM的表達，且APOM的表達與胰島素抵抗相關(guān)，但是RGZ可以使得APOM表達增加，具有逆轉(zhuǎn)作用〔3〕。另外Yang等〔4〕研究認為RGZ對細胞脂肪的改善是通過去乙?；?Sirtuin)途徑，Sirt被認為是葡萄糖和脂類代謝的傳感器，RGZ通過對Sirt1或Sirt1/Sirt6途徑的調(diào)節(jié)來改善脂肪變，使得脂肪細胞減少。然而，Yuan等〔5〕通過對間充質(zhì)干細胞衍生的血管瘤的研究表明，PPARγ可以分為四個亞型，其中PPARγ2主要存在于脂肪細胞，RGZ可以促進PPARγ2的基因表達，從而促進脂肪細胞的形成。本實驗表明RGZ可以抑制肝臟脂肪細胞的增生。

Luo等〔6〕研究發(fā)現(xiàn)RGZ通過P38信號途徑調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1從纖維細胞到成纖維細胞的轉(zhuǎn)化，抵抗纖維化的作用，減弱瘢痕的形成。康誼等〔7〕通過研究發(fā)現(xiàn)PPARγ作為一種核轉(zhuǎn)錄因子可能通過TGF-β1途徑調(diào)節(jié)肝纖維化進程，并且RGZ通過抑制膠原基因表達在動物體內(nèi)發(fā)揮抗纖維化作用。在本研究中T2DM組肝小葉失去正常結(jié)構(gòu)，門管區(qū)膠原大量沉積，可見大量膠原纖維自中央靜脈及門管區(qū)向周圍延伸，RGZ組肝臟膠原纖維的含量明顯比T2DM組降低，而通過羥脯氨酸法測得膠原蛋白含量的實驗也證實了這一理論。

本研究發(fā)現(xiàn)T2DM持續(xù)性高血糖毒性導致細胞凋亡增加，Bcl-xl抗體減少，進一步加重了細胞的凋亡。另外，T2DM肝臟脂肪變也能促進細胞凋亡增加〔7〕。有報道指出用Tunel原位雜交的方法觀察T2DM大鼠肝組織凋亡細胞，在正常組極少見肝細胞凋亡，T2DM組多出現(xiàn)藍黑色的圓形凋亡細胞，而RGZ治療組凋亡細胞明顯減少〔8〕。IL-17是一種主要由活化的CD4+T細胞產(chǎn)生的致炎細胞因子，具有強大的免疫致病性，可以促進T細胞激活和刺激成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞產(chǎn)生多種致炎因子，導致炎癥的發(fā)生〔9〕。持續(xù)的高血糖可以增加炎癥細胞的浸潤，炎癥介質(zhì)的釋放，從而進一步破壞肝細胞功能。但有研究表明當組織損傷時巨噬細胞會增多，但過多的巨噬細胞則可能會加重組織損傷，造成進一步的破壞并延遲修復。Das等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)羅格列酮使得組織巨噬細胞增多。

對初發(fā)T2DM的患者來說，使用RGZ進行治療能夠有效地降低血糖水平及胰島素抵抗指數(shù)，臨床效果顯著〔11〕。并且T2DM能夠治療非酒精性脂肪肝，通過改善組織對胰島素的敏感性，改善患者胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血脂，從而減輕其肝損傷，療效優(yōu)于二甲雙胍〔12〕。RGZ治療血糖調(diào)節(jié)受損患者，在降低血糖的同時，可以改善紅細胞變形能力，抑制機體炎癥反應，進一步改善胰島功能，預防T2DM并發(fā)癥的發(fā)生〔13〕。

1 Breuing IM，Shaya FT,McPherson ML,etal.Development of heart failure in medicaid patients with type 2 diabetes treated with pioglitazone,rosiglitazone,or metformin 〔J〕.JMCP,2014;20(9):895-903.

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3 Luo GH,Feng YH,Zhang J，etal.Rosiglitazone enhances apolipoprotein M (Apom) expression in rat′s liver〔J〕. Int J Med Sci,2014;11(10):1015-21.

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13 劉 璠，馮紅云，楊愛格，等.羅格列酮對糖調(diào)節(jié)受損患者紅細胞變形能力及炎癥因子的影響〔J〕.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2014；23(14)：1489-91.

〔2015-06-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

梁 玉(1960-)，女，碩士生導師，碩士，副教授，主要從事糖尿病研究。

王會敏(1988-)，女，在讀碩士，主要從事糖尿病研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)01-0051-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.023