費洪新 高 音 張英博 張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

蝙蝠葛蘇林堿對阿爾茨海默病小鼠海馬的影響和機制

費洪新 高 音 張英博 張曉杰

(齊齊哈爾醫(yī)學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探討蝙蝠葛蘇林堿(DS)對阿爾茨海默病(AD)小鼠影響及機制。方法 C57BL/6小鼠隨機分對照組、模型組、多奈哌齊組(0.001 g·kg-1)及DS高、中和低劑量組(1.08、0.54、0.27 g/kg)。采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42(80 pmol/μl)腦室注射誘導AD模型。治療30 d后測小鼠學習記憶能力，透射電鏡觀察海馬CA3區(qū)，測臟器指數(shù)和腦伊文氏藍(EB)，酶聯(lián)免疫吸附法測海馬β-淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)、Aβ1～42、白介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α、總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)。結果 與模型組比較，DS改善AD小鼠學習記憶能力(P<0.05)和海馬結構，明顯升高脾和胸腺指數(shù)(P<0.05)，其他臟器指數(shù)改變不明顯(P>0.05)，EB、APP、Aβ1-42、IL-1β、TNF-α和MDA明顯降低(P<0.05)，T-AOC、SOD和GSH-Px明顯升高(P<0.05)。結論 DS改善AD小鼠學習記憶及海馬結構，增強免疫和抗氧化，抑制APP、Aβ1-42、IL-1β和TNF-α可能是抗AD機制。

蝙蝠葛蘇林堿；阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(AD)是一種老年性、神經性和退行性疾病〔1〕。目前有許多治療AD的藥物，如乙酰膽堿酯酶(AChE)抑制劑〔2〕、抗氧化劑〔3〕和雌激素〔4〕等，但并沒有特效藥。AD學習記憶能力下降〔5〕且腦出現(xiàn)老年斑(SP)，SP來源β-淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)，SP核心是β-淀粉樣蛋白(Aβ)〔6〕，Aβ促進小膠質細胞(MG)及星形膠質細胞(As)活化〔7〕，神經元減少〔8〕，海馬神經元侵犯較為嚴重，血腦屏障(BBB)通透性改變等。AD表現(xiàn)活性氧(ROS)增加，引起總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)異常。AD引起大量炎癥介質釋放〔9〕，Aβ促進MG產生白細胞介素(IL)-1β等，促進As分泌腫瘤壞死因子(TNF)-α等〔10,11〕。慢性炎癥與AD密切相關〔12〕，非甾體類藥物減少Aβ沉積，降低AD發(fā)病風險〔13〕，延遲AD發(fā)作〔14〕。課題組前期研究顯示中藥北豆根成分蝙蝠葛酚性堿(PAMD)可治療AD〔15〕，PAMD包括蝙蝠葛堿(DAU)和蝙蝠葛蘇林堿(DS)等，DS對AD研究國內外尚處于空白，本實驗旨在探尋DS對AD小鼠影響及機制。

1 材料與方法

1.1 動物 36只清潔級C57BL/6小鼠，雄性，8周齡，體重(23±2)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2012-0001。

1.2 主要藥物和儀器 藥物：DS，成都曼斯特公司，批號：150306；APP、Aβ1～42、IL-1β、TNF-α等試劑盒，南京建成生物工程研究所；多奈哌齊，中國重慶植恩藥業(yè)有限公司，批號：20141201；Aβ1～42，Sigma公司；其他試劑為國產分析純。儀器：TCNAI-G2型透射電子顯微鏡(TEM)，荷蘭公司；6100型RT-雷杜酶標儀，美國RT公司；Morris水迷宮(MWM)，安徽淮北正華生物儀器有限公司等。

1.3 方法

1.3.1 復制AD模型 小鼠麻醉后，剪去頭頂毛發(fā)，固定小鼠，微量加樣器雙側腦室海馬區(qū)一次性注入10 μg凝聚態(tài)Aβ1～42(80 pmol/μl)，針頭留10 min，退針，封閉，包扎。對照組小鼠雙側腦室注射等量生理鹽水。

1.3.2 分組及給藥 C57BL/6小鼠36只隨機分對照組，模型組，多奈哌齊組，DS高、中、低劑量組，每組6只。對照組、模型組給予生理鹽水灌胃，多奈哌齊組給予多奈哌齊0.001 g/kg灌胃，DS高、中、低劑量組分別予DS 1.08、0.54、0.27 g/kg灌胃，給藥30 d。

1.3.3 MWM測定位航行能力 實驗結束后測定，MWM水深20 cm，水溫(23±2)℃，平臺放于第Ⅳ象限，第1、2、3、4天為訓練時間，每次訓練60 s，若60 s未找到移動平臺，將小鼠放平臺15 s，潛伏期記為60 s。第5天測潛伏期評價定位航行能力。

1.3.4 MWM測空間探索能力 實驗結束后過程同1.3.3，第5天撤去MWM平臺，檢測在60 s小鼠找到平臺的游泳距離，評價空間探索能力。

1.3.5 TEM觀察海馬CA3超微結構 實驗結束后小鼠心灌注2.5%戊二醛后，取材腦海馬、2.5%戊二醛固定、四氧化鋨固定、乙醇脫水、包埋、切片等，TEM觀察海馬CA3結構。

1.3.6 測臟器指數(shù) 實驗結束后稱取小鼠體重，冰上斷頭處死，解剖，取材心、肺、腎、肝、腦、脾和胸腺，洗凈，稱取臟器質量并計算。臟器指數(shù)(mg/g)=臟器質量(mg)/體重(g)。

1.3.7 測腦BBB通透性 使用腦伊文氏藍(EB)表示BBB通透性。實驗結束后小鼠尾靜脈注射2%EB，全身變藍后麻醉，心灌注70 ml生理鹽水，冰上迅速取腦，放入甲酰胺內，45℃避光孵育72 h，勻漿，離心機5 000 r/min離心10 min。6100型酶標儀于630 nm處測吸光度值(A)，根據(jù)EB標準曲線方程求出EB含量。EB含量用EB濃度/腦濕重(μg/g)表示。

1.3.8 檢測海馬抗氧化指標 實驗結束后小鼠麻醉，冰上解剖，取材海馬，按照試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)說明書測T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA。

1.3.9 ELISA檢測海馬蛋白表達 實驗結束后小鼠斷頭，迅速取海馬，勻漿，靜置，TGL-16G離心機5 000 r/min離心8 min，分裝，-20℃保存。6100型RT-雷杜酶標儀于450 nm波長測各孔吸光度(A)，繪制標準曲線，從方程求得APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 定位航行能力 定位航行能力用潛伏期表示。隨著訓練時間延長，小鼠潛伏期呈下降趨勢。與對照組比較，模型組潛伏期明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，DS高、中劑量組潛伏期明顯縮短(P<0.05)，見表1。

2.2 空間探索能力 空間探索能力用游泳距離表示，隨著訓練時間延長，小鼠游泳距離呈現(xiàn)下降趨勢。與對照組比較，模型組游泳距離明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，DS高、中劑量組游泳距離明顯縮短(P<0.05)，見表2。

組別第1天第2天第3天第4天第5天對照組58.22±0.9751.85±4.2941.96±5.3028.93±5.1125.24±4.96模型組59.31±0.3457.58±1.8053.28±3.6444.92±4.6141.07±5.771)多奈哌齊組58.52±0.6751.69±4.9543.83±4.7031.29±4.9027.04±6.602)DS高劑量組58.47±0.9151.48±3.2946.28±4.3732.28±4.3228.31±6.892)DS中劑量組58.28±0.8851.22±4.1044.18±6.5130.65±5.4526.75±7.332)DS低劑量組58.76±0.9057.23±1.2150.69±3.3342.21±4.5339.03±5.64

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；下表同

組別第1天第2天第3天第4天第5天對照組1257.86±155.001141.47±78.611038.75±112.57916.46±104.74725.47±89.19模型組1363.12±110.711289.06±114.841208.83±98.321177.19±109.861063.55±116.441)多奈哌齊組1365.38±70.941165.61±109.961072.67±143.88928.63±131.01753.38±103.012)DS高劑量組1305.96±92.921160.37±79.911066.77±143.38983.71±98.82777.37±90.442)DS中劑量組1350.26±91.681170.26±97.951059.72±148.13934.76±147.74780.57±129.322)DS低劑量組1333.46±57.651254.24±103.891199.53±123.761132.16±92.741072.89±128.06

2.3 TEM結果 對照組小鼠海馬CA3區(qū)神經元形態(tài)規(guī)則，胞體較大，核大而圓，細胞質豐富，線粒體豐富，高爾基體清晰。模型組神經元不規(guī)則，細胞質不豐富，核橢圓形，核膜不清楚，細胞器較少，線粒體輕度腫脹。DS高、中、低劑量組神經元較規(guī)則，細胞器不同程度增多，細胞結構較清晰，見圖1，圖2。

A：對照組；B：模型組；C：多奈哌齊組：D：DS高劑量組；E：DS中劑量組；F：DS低劑量組；下圖同圖1 海馬神經元結構(TEM，×2 550)

圖2 海馬神經元細胞質結構(TEM，×16 500)

2.4 臟器指數(shù) 與對照組比較，模型組小鼠心、肺、腎、肝、腦指數(shù)改變不明顯(P>0.05)；與模型組比較，DS高、中、低劑量組心、肺、腎、肝、腦指數(shù)改變不明顯(P>0.05)。另與對照組比較，模型組脾、胸腺指數(shù)明顯降低差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，DS高、中劑量組脾、胸腺指數(shù)明顯增加差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

組別心肺腎肝腦脾胸腺對照組5.68±0.566.28±0.4615.16±0.6041.85±2.85213.39±17.223.14±0.142.28±0.20模型組5.53±0.426.47±0.4215.43±0.6142.33±4.46225.55±16.362.71±0.161)1.74±0.211)多奈哌齊組5.62±0.516.31±0.4015.36±0.7341.42±2.51217.90±11.443.11±0.192)2.20±0.172)DS高劑量組5.76±0.516.25±0.4315.28±0.7841.82±4.81209.86±19.473.05±0.252)2.16±0.152)DS中劑量組5.84±0.476.29±0.5415.53±0.9641.68±4.21212.15±13.523.01±0.252)2.03±0.232)DS低劑量組5.79±0.476.31±0.3715.39±0.6741.35±5.05227.20±15.822.81±0.211.84±0.16

2.5 EB含量 以EB濃度為X，吸光度值(A)為Y，繪制EB標準曲線并求得回歸方程：Y=0.095 9X+0.077 2，R2=0.998 7。表明與對照組(1.06±0.34)比較，模型組小鼠腦EB含量(1.96±0.45)明顯升高(P<0.05)；與模型組(1.96±0.45)比較，多奈哌齊組(1.04±0.62)、DS高劑量組(1.18±0.82)、DS中劑量組(1.31±0.47)小鼠腦EB含量明顯降低(P<0.05)，而DS低劑量組(1.66±0.72)改變不明顯(P>0.05)。

2.6 海馬抗氧化指標 與對照組比較，模型組小鼠海馬T-AOC、SOD、GSH-Px明顯降低且MDA明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，DS高、中劑量組海馬T-AOC、SOD、GSH-Px明顯增加且MDA明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

組別T-AOC(nU/mg)SOD(U/mg)GSH-Px(nmol/g)MDA(μmol/g)APP(ng/L)Aβ1～42(ng/L)IL-1β(pg/ml)TNF-α(pg/ml)對照組1.25±0.27222.86±42.51543.84±31.348.24±0.99700.52±101.32160.84±36.02236.39±30.56947.57±108.08模型組0.73±0.161)129.47±18.521)459.63±32.271)11.16±0.681)887.28±89.491)220.69±27.411)321.17±21.431)1260.07±115.831)多奈哌齊組1.19±0.222)209.91±34.692)527.68±37.852)8.73±0.552)705.06±101.572)169.33±42.512)243.59±42.192)967.39±132.362)DS高劑量組1.15±0.312)197.35±13.532)519.82±53.622)9.23±0.632)712.93±124.722)173.07±22.172)254.83±34.472)992.94±112.922)DS中劑量組1.13±0.412)190.64±25.132)511.27±26.532)9.62±0.672)735.43±134.862)177.61±32.232)258.09±30.062)1000.17±125.262)DS低劑量組0.85±0.13152.52±17.29469.99±24.7810.87±0.84801.63±92.20195.87±44.31291.52±26.311173.22±118.01

2.7 海馬蛋白表達 與對照組比較，模型組小鼠海馬APP、Aβ1～42、IL-1β和TNF-α明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，DS高、中劑量組海馬APP、Aβ1-42、IL-1β和TNF-α明顯降低(P<0.05)，見表4。

3 討 論

AD中腦APP產生Aβ而形成SP，Aβ促進MG及As產生炎癥介質并侵犯海馬神經元，引起AD學習記憶下降，BBB通透性變化，腦ROS增加，基于這些實驗探尋DS對AD小鼠影響及機制。目前AD研究模型有Aβ注射〔16，17〕和轉基因動物〔18，19〕等。近年來多采用腦室注射Aβ建立AD模型，因此本實驗采用注射Aβ建立AD模型。

MWM表明模型組小鼠潛伏期及游泳距離增加，小鼠尋找到水下平臺比較困難，說明AD小鼠學習記憶能力減退，模型建立成功；DS高、中劑量對AD小鼠治療有效，使AD小鼠較快尋找到水下平臺，預示DS高、中劑量改善AD小鼠學習記憶。TEM觀察海馬CA3區(qū)神經元超微結構，顯示對照組海馬CA3區(qū)結構正常，無損傷；模型組CA3區(qū)結構損傷嚴重；DS各組CA3區(qū)神經元形態(tài)較規(guī)則，說明DS改善AD小鼠海馬結構，減輕海馬損傷。EB含量結果顯示，模型組腦EB增加，BBB受到損傷，BBB通透性增加，異常物質較容易進入腦；而DS高、中劑量降低腦EB，提示DS改善AD小鼠腦BBB通透性。

模型組小鼠脾、胸腺指數(shù)降低，提示AD小鼠免疫細胞數(shù)量降低，脾B細胞數(shù)量降低且胸腺T細胞較少，提示體液免疫及細胞免疫水平降低，綜合顯示小鼠免疫力降低；經過DS治療后脾、胸腺指數(shù)增加，預示DS高、中劑量促進體液免疫漿細胞及細胞免疫T細胞數(shù)量增加，提示小鼠免疫功能增加。模型組小鼠海馬抗氧化指標降低且氧化產物升高，預示模型組小鼠腦抗氧化能力減弱，ROS升高；而DS高、中劑量增加抗氧化指標且氧化產物減少，說明DS高、中劑量改善AD小鼠抗氧化能力。

在AD初期MG吞噬Aβ，伴隨Aβ產生增加，MG吞噬作用減弱，逐漸激活MG分泌功能，繼而激活As分泌功能，產生大量炎癥介質反過來激活MG和As，產生放大效應，促進Aβ進一步增加，加速AD進程。因此需檢測AD相關蛋白和炎癥介質。結果表明，模型組小鼠海馬APP、Aβ1-42、IL-1β和TNF-α增加，預示AD腦Aβ大量積聚，引起了機體多種反應，激活MG和As，產生較多炎癥介質，顯示炎癥反應明顯；經過DS治療后AD相關蛋白和炎癥介質降低，說明DS高、中劑量減少Aβ積聚，減輕AD腦炎癥反應。以上提示腦APP、Aβ1-42與IL-1β、TNF-α存在一定相關性，預示其是AD重要評價指標。

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〔2015-02-23修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of Daurisoline on hippocampus in Alzheimer′s disease mice and its mechanisms

FEI Hong-Xin，GAO Yin，ZHANG Ying-Bo，et al.

Qiqihar Medical University，Qiqihaer 161006，Heilongjiang，China

Objective To explore the effect of Daurisoline(DS) on hippocampus in Alzheimer′s disease(AD) mice and its mechanisms.Methods C57BL/6 mice were randomly divided into control，model，Donepezil (0.001 g/kg)，DS high-dose (1.08 g/kg)，DS medial-dose (0.54 g/kg)，DS low-dose (0.27 g/kg) groups. The Aβ1～42(80 pmol/μl) was injected into the bilateral hippocampus of mice to induce AD model. The mice were killed after 30 days continuous treating. The Morris water maze was used to observe the learning and memory ability. Pathological changes of the hippocampus CA3 area were detected by transmission electron microscope. The viscera indices in mice were measured by electronic balance. The levels of APP, Aβ1～42,IL-1β, TNF-α, T-AOC, SOD, GSH-Px and MDA in the hippocampus were measured by ELISA.Results Compared with that of model group，DS significantly improved the learning and memory ability of AD mice(P<0.05).The brain maintain normal morphological structure of nerve cells and the organ index of spleen and thymus organ in DS dose groups were significantly increased(P<0.05).The EB content of AD mice was significantly decreased (P<0.05)，the levels of APP, Aβ1～42, IL-1β, TNF-α and MDA were significantly decreased(P<0.05)，the contents of T-AOC, SOD and GSH-Px were significantly increased(P<0.05).Conclusions DS could improve the ability of learning and memory of AD mice and normal morphological structure of nerve cells and organ coefficients of spleen and thymus organ. DS plays a certain role in the treatment of AD through inhibiting APP, Aβ1～42, IL-1β and TNF-α.

Daurisoline；Alzheimer′s disease

國家自然科學基金 (81173576，81373777，81373599)；教育部重點項目(210068)

高 音(1969-)，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事癡呆、腦損傷機制研究。

費洪新(1978-)，男，博士，講師，黑龍江中醫(yī)藥大學中醫(yī)學博士后科研流動站，在站人員，主要從事癡呆、腫瘤、抑郁和痛風研究。

R285

A

1005-9202(2017)01-0009-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.004