邱 薇 ， 胡挺松 ， 王文博 ， 余 靜 ， 陳 剛 ， 張富強(qiáng) ， 鄭 穎 ， 范泉水

(成都軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心 ， 云南 昆明 650118)

由犬細(xì)小病毒引起的犬細(xì)小病毒病是一種急性、以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征的犬科和鼬科動(dòng)物重要傳染病。CPV對(duì)外界的抵抗力強(qiáng)，存活時(shí)間長，故其傳染性極強(qiáng)，各種年齡的犬都能感染，可引起犬出血性腹瀉和心肌炎，并使白細(xì)胞大量減少，在幼犬中的發(fā)病率和死亡率都很高，癥狀與貓泛白細(xì)胞減少癥相似。CPV有兩種不同的血清型，即CPV-1型和CPV-2型。日本、德國和美國從自然發(fā)病的貓分離到CPV-2 a型和CPV-2 b型，這些貓都出現(xiàn)顯著的白細(xì)胞減少癥。CPV-2又分為CPV-2 a型和CPV-2 b型兩種亞型。近年來又出現(xiàn)了CPV-2 c型，每次變異都引起病毒在致病性和宿主嗜性方面的變化[1-2]。2010年，我國檢測(cè)到CPV 2 c型毒株[3]，但目前我國還是以CPV-2 a型和CPV-2 b型為主要流行毒株[4]。

CPV基因組編碼的結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2在病毒感染過程中起著極為重要的作用，缺失VP1蛋白或VP2蛋白的突變體毒株均喪失了對(duì)宿主細(xì)胞的再感染性，VP2蛋白上的幾個(gè)關(guān)鍵堿基和氨基酸的變化就會(huì)改變抗原特性和宿主范圍，VP1蛋白氨基酸序列包含整個(gè)VP2蛋白的氨基酸序列，且終止于共同的C端[5]。 VP1蛋白比VP2蛋白在其氨基端多出一段序列，且富含堿性氨基酸殘基[6]。VP2基因的5`端以及該基因上的蛋白轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)區(qū)loop1和loop3是重要的B細(xì)胞抗原表位區(qū)，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，這些區(qū)域氨基酸殘基的變化是導(dǎo)致CPV毒株抗原漂移的主要原因，傳染性病毒粒子包含60個(gè)蛋白亞基，主要由VP2亞基、少量的VP1和VP3亞基組成[7]。有證據(jù)顯示，桿狀病毒或疫苗載體表達(dá)的僅由VP2組裝的CPV空衣殼和真正的空衣殼在抗原性上相似，說明VP1和VP2在功能上可能具有相同的作用[8]。還有研究[9,10]表明，VP1和VP2基因均可誘導(dǎo)犬產(chǎn)生中和抗體，并能保護(hù)犬抵御強(qiáng)毒的攻擊。

本研究從發(fā)病死亡犬的腸內(nèi)容分離到1株犬細(xì)小病毒野毒株，通過PCR獲得其VP1基因，測(cè)序后經(jīng)基因分型，該毒株屬于CPV-2 a型。利用基因免疫制備單克隆抗體的方法，構(gòu)建了該毒株VP1基因的基因疫苗，獲得了3株具有不同抗原表位及CPV中和活性的單克隆抗體，為CPV在臨床診斷及治療方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌JM109 、真核表達(dá)載體pcDNA3、貓腎F81傳代細(xì)胞和SP2/0骨髓瘤細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。 BALB/c小鼠，購自昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。病料取自昆明某基地死亡犬腸內(nèi)容物。病毒RNA/DNA提取試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR產(chǎn)物膠回收試劑盒、質(zhì)粒(小量)抽提試劑盒，購自上海華舜試劑有限公司；引物合成、純化及測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 引物的合成 合成1對(duì)擴(kuò)增CPV VP1全基因的引物，上游引物中含BamH I限制位點(diǎn)，下游引物中含NotI限制位點(diǎn)，用ddH2O按20 pmol/μL稀釋，-20 ℃凍存。引物序列如下：

P15′-CGGGATCCATGCTTGTGCCTCCAGGTT-3′；

P25′-GTGCGGCCGCATTTTCTAGGTGCTAGT-3′。

1.3 犬細(xì)小病毒的分離 取病犬腸內(nèi)容物，以PBS作10倍稀釋后，10 000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm膜除菌后接種剛傳代的F81細(xì)胞，37 ℃吸附1 h后，換維持液繼續(xù)培養(yǎng)4-5 d，每天觀察有無細(xì)胞病變。出現(xiàn)細(xì)胞病變的，待有70%左右的細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收毒。

1.4 CPV VP1基因的克隆及序列分析 用試劑盒抽提CPV總DNA，配制PCR反應(yīng)體系50 μL：模板CPV DNA 2 μL，10×Buffer 5 μL，MgCl25 μL，dNTP 4 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，無菌蒸餾水31.5 μL。PCR反應(yīng)條件：96 ℃ 3 min，(96 ℃ 30 s、52 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s)30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。電泳回收VP1蛋白基因片段并與用BamH I和NotⅠ雙酶切后回收的pcDNA3載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，應(yīng)用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。

1.5 細(xì)胞融合及陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 選擇8～12周齡BALB/c小鼠，每只鼠兩后肢脛前肌各注射50 μL乳化好的基因疫苗，兩周后同樣劑量加強(qiáng)免疫，融合前10 d最后1次免疫。第1次免疫后第3周和第5周分別采血，測(cè)定抗體水平。將免疫鼠的脾淋巴細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的(SP2/0)融合并將融合細(xì)胞加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，每孔50 μL，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用1∶100稀釋的CPV為抗原，1∶10 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗，經(jīng)間接ELISA法篩選陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行3～4次克隆純化。

1.6 腹水的制備 將0.5 mL高壓滅菌的石蠟油注射到小鼠腹腔，1周后注入1×106個(gè)雜交瘤細(xì)胞于小鼠腹腔。7～10 d后當(dāng)小鼠腹部極度膨脹時(shí)，抽取腹水，1 500 r/min離心10 min，取上清，加等體積的滅菌甘油，混勻，放-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 雜交瘤細(xì)胞上清與腹水效價(jià)的測(cè)定 將雜交瘤細(xì)胞上清用PBS分別從4倍至256倍做2倍稀釋，正常SP2/0細(xì)胞培養(yǎng)上清作陰性對(duì)照；制備的腹水用PBS從6.4×102至2.048×104做2倍稀釋，正常小鼠腹水作陰性對(duì)照，分別做間接ELISA檢測(cè)，每個(gè)細(xì)胞株、腹水2孔重復(fù)，取其平均OD值，OD值超過陰性對(duì)照1倍即判為陽性，其最大稀釋度為抗體效價(jià)。

1.8 單克隆抗體特異性鑒定 用犬細(xì)小病毒、犬瘟熱病毒、貓細(xì)小病毒、流感病毒、犬腺病毒以及F81細(xì)胞上清分別包被酶標(biāo)板，加入1∶2 000稀釋的腹水，進(jìn)行間接ELISA，檢測(cè)制備的單抗的特異性。

1.9 單克隆抗體體外中和試驗(yàn) 用營養(yǎng)液將CPV的細(xì)胞培養(yǎng)物稀釋成200 TCID50/0.1 mL，將各單抗分別用營養(yǎng)液從64倍至2 056倍做2倍稀釋，取每個(gè)稀釋度的腹水0.1 mL加入0.1 mL病毒液，37 ℃置1 h，然后同步接種Vero細(xì)胞，每稀釋度重復(fù)4孔，于37 ℃、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長情況。同時(shí)設(shè)立病毒、陽性血清、陰性血清(正常BALB/c小鼠血清)、腹水和營養(yǎng)液對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 VP1基因擴(kuò)增 經(jīng)PCR擴(kuò)增得到大小約為2 200 bp的片段，與預(yù)期值相符，見圖1。

圖1 細(xì)小病毒VP1基因PCR擴(kuò)增

M:Marker DL-2 000 ; 1. 陽性對(duì)照 ； 2. 樣品DNA PCR產(chǎn)物

2.2 pcDNA3-VP1重組質(zhì)粒的鑒定 獲得的重組質(zhì)粒用PCR方法和BamHⅠ及NotⅠ雙酶切鑒定，PCR結(jié)果為陽性，酶切結(jié)果表明重組質(zhì)粒中含有2.2 Kb的片段，見圖2。

圖2 重組質(zhì)粒的鑒定

M: Marker DL-15 000 ； 1: 重組質(zhì)粒PCR鑒定 ；2: 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

2.3 VP1基因序列測(cè)定及分析 基因測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)菌株BR8155-00(CPV-2 a型)株的VP1全基因序列和氨基酸序列相比較，核苷酸同源性為99.47%，氨基酸的同源性為99.17%。在第72、185、412、532、579位及669位的氨基酸發(fā)生突變。CPV-2 a 型和CPV-2 b型只有569位氨基酸不同，569為D是CPV-2 b型特有的，569N為CPV-2 a型。本試驗(yàn)所測(cè)的毒株的569位的氨基酸為N，表明該毒株為CPV-2 a型。重組質(zhì)粒pcDNA3-VP1即為構(gòu)建的基因疫苗。

2.4 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選 選擇兩只抗體較高的小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，以CPV為抗原，辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠二抗，經(jīng)間接ELISA法篩選得到3株陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行3～4次克隆純化。

2.5 雜交瘤細(xì)胞上清與腹水效價(jià)的測(cè)定 通過細(xì)胞融合，獲得3株穩(wěn)定分泌抗犬細(xì)小病毒VP1蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，用間接ELISA方法測(cè)定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和腹水，上清效價(jià)為1∶16、1∶32 和1∶32；腹水效價(jià)為1∶25 600、1∶51 200和 1∶51 200。見表1。

2.6 單克隆抗體的特異性鑒定 3株單抗與CPV和FPV發(fā)生反應(yīng)，均不與CDV、CAV和AIV發(fā)生反應(yīng)。見表2。

表1 雜交瘤細(xì)胞株上清效價(jià)測(cè)定

表2 單克隆抗體的特異性鑒定結(jié)果

+: 陽性; -: 陰性

2.7 單克隆抗體的中和試驗(yàn) 經(jīng)病毒中和試驗(yàn)，3株單抗中，CPV～VP1-2和CPV～VP1-3兩株單抗對(duì)病毒有較強(qiáng)的中和能力，腹水的中和效價(jià)均為1∶256，而CPV～VP1-1株單抗腹水的中和效價(jià)小于1∶128。

3 結(jié)論與討論

基因疫苗由病原的保護(hù)性抗原基因及載體質(zhì)粒兩部分組成。應(yīng)用基因疫苗制備單抗為免疫學(xué)研究及疾病治療提供了一個(gè)全新的方法。人們可以根據(jù)需要，將針對(duì)任何抗原表位的基因克隆到真核表達(dá)載體中，免疫小鼠制備所需的抗體。對(duì)那些難以制備和純化的抗原以及在純化過程中其結(jié)構(gòu)易被破壞的抗原來說尤為適用。對(duì)于一些烈性傳染病，應(yīng)用基因疫苗制備單抗，比直接用病原體作抗原要安全得多。到目前為止，已有基因免疫制備單抗的報(bào)道。Barry等以人生長激素的基因疫苗免疫BALB/c小鼠，一次融合，即克隆篩選到20株抗hGH的單抗，這是最早以基因疫苗制備單抗的報(bào)道，

從而首次證明了基因免疫制備單抗的可行性。Schmolke等以人乙型肝炎病毒E2糖蛋白基因疫苗研制出8株抗乙肝病毒的單抗，用于鑒定其病毒粒子，這為基因疫苗及其單抗的研制提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

為了深入研究 CPV-2 的起源、病原特性、致病機(jī)理以及診斷和防治措施，國內(nèi)外學(xué)者開展了CPV-2 單克隆抗體的研究工作，用于CPV-2 濃縮與純化、起源與抗原變異、抗原結(jié)構(gòu)分析、抗CPV-2單抗S獨(dú)特型抗體的研究以及用于CPV-2 抗體和抗原的檢測(cè)[11]。王凈等用CPV-2 a 型分離株制備了4 株單抗且與狂犬病病毒、犬瘟熱病毒無交叉反應(yīng)；同時(shí)建立了雙抗夾心ELISA 方法，對(duì)病毒的最低檢出量為4.375 μg/mL，與美國RB 試劑盒相比，符合率為95%[12]。賀英等以純化的酵母重組表達(dá)的犬細(xì)小病毒VP2單位獲得4株能穩(wěn)定分泌抗犬細(xì)小病毒CPV結(jié)構(gòu)蛋白VP2的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，這些單抗僅與CPV及其VP2發(fā)生特異性反應(yīng)，而與CDV和CAV-1及CAV-2沒有交叉反應(yīng)，其中2株屬于IgG2b亞類，2株屬于IgG1亞類[13]。劉潔等用F81培養(yǎng)的CPV經(jīng)滅活、純化后制備單抗，獲得2 株分泌抗CPV 單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，Ig亞類均為IgG1[14]。

本研究通過基因疫苗免疫制備單抗的方法制備了CPV的單抗，省去了復(fù)雜的抗原制備過程，但是由于基因疫苗的免疫效果沒有純化的病毒粒子及純化的蛋白質(zhì)的免疫效果好，使得免疫小鼠以及雜交瘤細(xì)胞上清和腹水的效價(jià)都不夠高，因此該方法制備的單抗一般中和效價(jià)也不高，不適合用于細(xì)小病毒感染的治療，但有可能篩選到特異性較好的單抗，適用于建立細(xì)小病毒快速診斷方法，為CPV的快速診斷方法的建立及改進(jìn)奠定基礎(chǔ)。

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