馬晶晶, 高俊鋒， 吳碧清， 韓相敏， 李桃梅， 賴 志

(1.上海創(chuàng)宏生物科技有限公司 ， 上海 松江 201619 ； 2.上海伊科拜克獸藥銷售有限公司 ， 上海 長寧 201101)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒 (PRRSV) 是一種嚴(yán)重影響全球養(yǎng)豬業(yè)的重要病原，可給養(yǎng)豬生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，所致疫病為豬繁殖與呼吸綜合征 (PRRS)，在我國俗稱“豬藍(lán)耳病”，以母豬繁殖障礙和生長豬的呼吸道疾病為特征[1]，主要表現(xiàn)為母豬發(fā)熱、厭食和早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙，新生及斷奶前仔豬高死亡率[2-3]。

PRRSV為單股正鏈RNA病毒，約15 kb，有9個(gè)開放閱讀框，極易變異和演化，呈現(xiàn)毒株的多樣性與致病性[4]，特別是高致病性毒株和流行新毒株的不斷出現(xiàn)，以及豬場PRRS活疫苗的不正確使用，使疫病的局部暴發(fā)和再流行趨勢(shì)蔓延。PRRSV 基因組的變異主要集中于非結(jié)構(gòu)蛋白 Nsp2編碼區(qū)、結(jié)構(gòu)蛋白ORF5和ORF3基因；結(jié)構(gòu)蛋白ORF7則是相對(duì)保守的區(qū)段[5]。本試驗(yàn)旨在通過田間試驗(yàn)的臨床觀察和生產(chǎn)統(tǒng)計(jì)結(jié)合分子生物學(xué)方法分析豬場PRRSV疫情與豬群存在PRRSV基因型的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)豬場 某南方養(yǎng)殖場生產(chǎn)3線，生產(chǎn)母豬900頭。2014年5月開始出現(xiàn)產(chǎn)房母豬高燒、流產(chǎn)和產(chǎn)不合格仔豬(不合格仔豬指死胎、木乃伊胎和弱仔，弱仔標(biāo)準(zhǔn)：初生個(gè)體重<0.7 kg)。平均胎產(chǎn)不合格仔豬數(shù)為2.45頭/窩。6月份母豬流產(chǎn)增加，達(dá)18窩/周。對(duì)豬場使用藍(lán)耳病疫苗情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)：自2012年先后使用過V2332活疫苗、JXA-1R株活疫苗、自家苗(滅活疫苗)。目前，使用TJM-F92株活疫苗。

1.1.2 主要試劑 泰萬菌素，購自浙江伊科拜克動(dòng)物保健品有限公司；病毒基因組提取試劑盒，購自北京天根生物科技有限公司；PCR試劑耗材，購自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)豬瘟病毒(CSFV)、細(xì)小病毒(PPV)、圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、偽狂犬病病毒(PRV)和豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)基因組設(shè)計(jì)診斷引物；根據(jù)PRRSV NSP2區(qū)段的基因序列特征設(shè)計(jì)鑒別引物，退火溫度和擴(kuò)增片段見表1。

1.2.2 PCR或RT-PCR檢測 取胎衣、臍帶血和流產(chǎn)胎兒肺等病料，按照試劑盒說明書提取病毒DNA和RNA，RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取提取的DNA和反轉(zhuǎn)錄的cDNA用PRRSV、細(xì)小病病毒、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

表1 檢測引物序列

1.2.3 用藥 在試驗(yàn)豬場飼料中添加泰萬菌素進(jìn)行飼喂，用藥時(shí)間和劑量見表2。

表2 試驗(yàn)用藥方案

1.2.4 生產(chǎn)數(shù)據(jù)記錄 從用藥前14 d至用藥后98 d，以7 d為周期，對(duì)母豬流產(chǎn)數(shù)、胎產(chǎn)不合格仔豬數(shù)、胎產(chǎn)全死胎、木乃伊胎母豬數(shù)和保育舍死淘仔豬數(shù)等生產(chǎn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.5用藥后不同類型毒株P(guān)RRSV檢測 按表3所示，采樣方案分別采集胎衣、臍帶血、流產(chǎn)胎兒肺等病料和血清，分別按照試劑盒說明書提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用PRRSV鑒別引物進(jìn)行擴(kuò)增，記錄病料和血清中PRRSV經(jīng)典毒株、高致病性野毒、高致病性疫苗毒所占比例，并分析所有檢測項(xiàng)目中經(jīng)典PRRSV經(jīng)典毒株、高致病性野毒、高致病性疫苗毒所占比例。

表3 試驗(yàn)采樣方案

2 結(jié)果

2.1 流產(chǎn)原因診斷結(jié)果 通過對(duì)病料組織及血清PCR檢測，檢測結(jié)果細(xì)小病病毒、圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病病毒、豬瘟病毒均為陰性，PRRSV為陽性。從而可以判定PRRSV是引起這次流產(chǎn)的主要病原。

2.2 流產(chǎn)母豬統(tǒng)計(jì)結(jié)果 用藥后，流產(chǎn)母豬數(shù)從用藥前的18頭/周下降至用藥后7 d的2頭/周，21 d降至0頭/周(見圖1)。

2.3 胎產(chǎn)不合格仔豬數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 用藥前母豬胎產(chǎn)不合格仔豬數(shù)在2.24～2.45頭/胎，用藥時(shí)為3.63頭/胎；隨著用藥時(shí)間推移，胎產(chǎn)不合格仔豬數(shù)逐步下降，到用藥35 d時(shí)下降至1.32頭/胎；用藥84 d時(shí)降為0.78頭/胎(見圖2)。

2.4 胎產(chǎn)全死胎、黑胎母豬數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果 用藥前胎產(chǎn)全死胎、木乃伊胎母豬數(shù)為4～7頭，用藥后35 d降為0，并持續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束(見圖3)。

2.5 保育死亡淘汰豬數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果 用藥前14 d保育死亡淘汰豬為47頭，用藥后21 d降為17頭，隨后一直穩(wěn)定在10～20頭之間，直至試驗(yàn)結(jié)束(見圖4)。

2.6 RT-PCR檢測試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 所有樣品RT-PCR檢測結(jié)果 從用藥前至用藥后90 d， PRRSV總陽性率從85.7%下降至14.3%；經(jīng)典毒和野毒陽性率均逐漸下降，至用藥后70 d檢測結(jié)果均為陰性；PRRSV疫苗毒株從42.9%下降至14.3%。高致病性野毒陽性率趨勢(shì)圖見圖5，毒株比重趨勢(shì)圖見圖6。PRRSV疫苗毒株經(jīng)鑒定為藍(lán)耳病疫苗毒株天津株。見圖5、6、7。

圖1 用藥前后流產(chǎn)母豬統(tǒng)計(jì)

圖2 用藥前后胎產(chǎn)不合格仔豬統(tǒng)計(jì)

圖3 用藥前后胎產(chǎn)全死胎、黑胎母豬數(shù)量統(tǒng)計(jì)

圖4 用藥前后保育豬死淘數(shù)統(tǒng)計(jì)

圖5 所有樣品各批次野毒陽性率趨勢(shì)

圖6 所有樣品各批次毒株比重趨勢(shì)

圖7 病料和血清毒株P(guān)RRSV鑒別診斷RT-PCR擴(kuò)增

1：20140905病料樣品 ； 2：20140905血清樣品 ； 3：PRRSV天津株 ；N：陰性對(duì)照 ； M：DL-2 000 DNA Marker

2.6.2 血清、病料樣品RT-PCR分檢測結(jié)果 用藥前血清樣品中總陽性率為42.9%，用藥后30 d為2.9%，隨后趨于穩(wěn)定；經(jīng)典毒、高致病性野毒和高致病性疫苗毒在用藥后30 d陽性率≤2.9%。

用藥前病料樣品中總陽性率為42.9%，用藥后≤28.6%；經(jīng)典毒、高致病性野毒在用藥后50 d至試驗(yàn)結(jié)束時(shí)均≤5.7%；高致病性疫苗毒在用藥后陽性率無顯著變化，見圖8。

圖8 病料、血清樣品RT-PCR檢測結(jié)果

3 討論

近年來，在免疫過PRRSV的豬場仍暴發(fā)PRRS的報(bào)道呈增加趨勢(shì)，給豬場帶來了很大的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，表明PRRSV的重組或變異與各類型PRRSV的種類及病毒血癥周期長短有一定關(guān)系[8]。

本試驗(yàn)選擇在免疫過多種疫苗，而母豬仍出現(xiàn)高燒、流產(chǎn)和產(chǎn)不合格仔豬的豬場進(jìn)行。檢測發(fā)現(xiàn)，該豬場存在PRRSV經(jīng)典毒、高致病性野毒和高致病性疫苗毒3種毒株亞型。有研究報(bào)道，泰萬菌素對(duì)PRRSV有抑制作用[6-7]，本試驗(yàn)對(duì)母豬飼喂泰萬菌素后，PRRSV毒株亞型數(shù)減少，同時(shí)母豬流產(chǎn)數(shù)、胎產(chǎn)不合格仔豬數(shù)、胎產(chǎn)全死胎、木乃伊胎母豬數(shù)和保育舍死淘數(shù)均呈下降趨勢(shì)，逐漸趨于平穩(wěn)，表明豬群感染PRRSV基因類型越單一，豬群越平穩(wěn)。

PRRSV的變異性會(huì)導(dǎo)致致病性增強(qiáng)的新毒株出現(xiàn)，一旦成為優(yōu)勢(shì)毒株將造成PRRS的暴發(fā)。新近的研究表明，從一些發(fā)生PRRS的豬場分離到與 HP-PRRSV減毒活疫苗病毒高度同源的毒株，且分離毒株呈現(xiàn)對(duì)豬的致病性增強(qiáng)，為這一現(xiàn)象提供了有力的證據(jù)[9]。目前，我國 PRRSV減毒活疫苗應(yīng)用廣泛，疫苗病毒的回復(fù)突變和毒力返強(qiáng)以及與野毒株重組的現(xiàn)象成為豬場新的PRRS防控難題。因此，在防控PRRS時(shí)，活疫苗種類不可盲目貪多，減毒活疫苗的合理使用十分必要[11]，這不僅有利于有效阻止疫苗病毒的演化和毒力回復(fù)返強(qiáng)，而且可降低疫苗病毒與野毒重組而產(chǎn)生新毒株的幾率，并延緩 PRRSV變異和演化的速度[8, 10]。

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