許英民

（黑龍江省鐵力市獸醫(yī)專(zhuān)家門(mén)診 黑龍江伊春 152500）

斷奶仔豬副豬嗜血桿菌分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

許英民

（黑龍江省鐵力市獸醫(yī)專(zhuān)家門(mén)診 黑龍江伊春 152500）

黑龍江省鐵力市某原種豬場(chǎng)，有 216 頭斷奶仔豬，對(duì)其中患病仔豬進(jìn)行臨床及剖檢的觀察疑似副豬嗜血桿菌感染對(duì)該病例進(jìn)行詳細(xì)分離，通過(guò)細(xì)菌分離形態(tài)培養(yǎng)、生化試驗(yàn)、PCR 鑒定和藥敏試驗(yàn)等，確定該分離菌株為副豬嗜血桿菌。測(cè)定該臨床上常用抗菌藥物對(duì)分離菌株的敏感性，結(jié)果顯示，對(duì)頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林、頭孢噻肟敏感，對(duì)頭孢噻吩、氨芐青霉素、新霉素、頭孢三嗪等 8 種藥物耐藥性，說(shuō)明分離菌株抗藥性比較嚴(yán)重。所以，提示臨床防治該病時(shí)，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行防治。

斷奶仔豬；副豬嗜血桿菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

副豬嗜血桿菌病又稱(chēng)豬多漿膜炎綜合征、或稱(chēng)豬纖維蛋白性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎、革拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌（H.parasuis）引起的，在臨床上以體溫升高、關(guān)節(jié)腫脹、呼吸困難、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和高死亡率為主要特征的傳染病，危害仔豬和保育豬的健康。尤其是在經(jīng)高致病性藍(lán)耳病等免疫抑制性疫病發(fā)生并引起免疫功能下降后，副豬嗜血桿菌病更為嚴(yán)重，使豬場(chǎng)蒙受更大的經(jīng)濟(jì)損失。副豬嗜血桿菌可以影響2周齡至3月齡的仔豬和保育豬，多發(fā)生在斷奶前后和保育期的豬，一般常見(jiàn) 5～7周齡的豬，死亡率一般在 15～19%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá) 50%左右。最近筆者在某原種豬場(chǎng)進(jìn)行診斷，對(duì)該場(chǎng)斷奶仔豬發(fā)生的疑似病例，進(jìn)行菌株的分離鑒定，為該病的防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 病料來(lái)源

在黑龍江省鐵力市某原種豬場(chǎng)出現(xiàn)的副豬嗜血桿菌病疑似癥狀中，采用無(wú)菌采集病死斷奶仔豬的心、肝、脾、肺和淋巴結(jié)等器官組織和關(guān)節(jié)積液。

1.2 主要儀器

高壓滅菌器、生化培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、顯微鏡、冰箱、常用玻璃器材等。

1.3 主要試劑

副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)抗血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品檢查所；麥康凱瓊脂、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、鮮血瓊脂、伊紅美蘭瓊脂、普通肉湯、生化發(fā)酵管、藥敏紙片等，均由我們實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)小白鼠購(gòu)自小動(dòng)物飼養(yǎng)場(chǎng)，斷奶仔豬由黑龍江省鐵力市某原種豬場(chǎng)提供。

2 方法

2.1 涂片鏡檢

用病死斷奶仔豬的肝臟、心血、關(guān)節(jié)積液，分別涂片或沫片，革蘭氏染色，鏡檢。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

取病死斷奶仔豬的肝臟、心包液、腦組織、關(guān)節(jié)液、分別接種普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、巧克力瓊脂，鮮血瓊脂和麥康凱培養(yǎng)基上，經(jīng) 37℃培養(yǎng) 24～48h。再挑取平板上針尖大小、透明的小菌落，劃線于巧克力瓊脂平板上。挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

2.3 生化試驗(yàn)

將分離到的純培養(yǎng)菌株分別接種于蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蛋白胨、山梨醇、甘露醇、尿素酶生化鑒定試管內(nèi)，每個(gè)試管中加入 1μm0.3%NAD（煙酰胺嘌呤二核苷酸），置于 37 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24h, 待觀察生化反應(yīng)。

2.4 PCR鑒定

根據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)合成下列引物，即 P1：5′-TATCGRGAGATGAAAGAC-3,P2：5′ -GTAATGTCTAAGGACTAG-3′ ,P3：5′-CCTCGCGGCTTCGTC-3′ ，擴(kuò)增產(chǎn)物為 1090bp 左右的片段，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 產(chǎn)物，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察檢測(cè)結(jié)果。

2.5 藥敏試驗(yàn)

按 K-B 紙片擴(kuò)散法將被檢細(xì)菌涂布接種于普通瓊脂平板上，間隔一定距離貼上各種藥敏試紙，于 37 ℃培養(yǎng) 16～18h 后，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 病料檢查

病料涂片檢查，采用無(wú)菌操作取病死豬的肝臟、心包液、腦組織、關(guān)節(jié)液涂片，革蘭氏染色，鏡檢，可見(jiàn)長(zhǎng)絲狀、球狀的細(xì)菌。

3.2 細(xì)菌分離與培養(yǎng)

可觀察到在巧克力瓊脂平板上長(zhǎng)出針尖大小、無(wú)色透明、光滑濕潤(rùn)、邊緣整齊而呈圓形的菌落。取菌落涂片，用革蘭氏染色，可見(jiàn)長(zhǎng)絲狀、桿狀、球狀等多形態(tài)的短小革蘭氏陽(yáng)性桿菌，多單個(gè)存在或呈短鏈狀排列。與直接涂片鏡檢的結(jié)果相同。另挑取該菌落接種于兔血瓊脂平板上，再用金黃色葡萄球菌點(diǎn)種，呈現(xiàn)“衛(wèi)星生長(zhǎng)”現(xiàn)象。

3.3 生化試驗(yàn)

分離到的菌株能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、葡萄糖，而蛋白胨、山梨醇、甘露醇、尿素酶生化反應(yīng)為（-），不能發(fā)酵分解乳糖、甘露醇。

3.4 PCR檢測(cè)結(jié)果

分離菌株提取的 DNA 樣品經(jīng) PCR 擴(kuò)增，在 1090bp 的位置出現(xiàn)特異的條帶，與之前各文獻(xiàn)上報(bào)道的副豬嗜血桿菌 PCR 檢測(cè)結(jié)果一致，分離菌株被鑒定為副豬嗜學(xué)桿菌。

3.5 藥敏試驗(yàn)

根據(jù)藥敏紙片標(biāo)簽說(shuō)明，抑菌圈在 0～10mm 為低敏，10～15mm 為中敏，15mm 以上為高敏。根據(jù)該判定標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果抑菌圈在 15mm 以上，即為高敏的藥物有，頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林；抑菌圈在 10～15mm 為中敏的有丁胺卡那霉素、頭孢氨芐、新霉素；抑菌圈在 0～10mm，即為低敏的有鏈霉素、多粘菌素、復(fù)方新諾明。

4 小結(jié)與討論

副豬嗜血桿菌病是豬的重要細(xì)菌性疾病之一，屬于條件性細(xì)菌病，細(xì)菌侵入于上呼吸道內(nèi)，可受其他疾病繼發(fā)、環(huán)境應(yīng)激等多種因素的誘發(fā)，使得病情加重。近些年來(lái)，呈愈演愈烈的趨勢(shì)。該菌可通過(guò)空氣直接接觸感染其健康豬，也可通過(guò)消化道傳播。在冬春季節(jié)此病多發(fā)，豬場(chǎng)內(nèi)環(huán)境條件差、營(yíng)養(yǎng)不佳和管理不善等因素均可引起發(fā)病。

由于本病為機(jī)體常在菌，如果抵抗力低下，就會(huì)引起發(fā)病。對(duì)于新購(gòu)入的仔豬，無(wú)論運(yùn)輸、飼喂及生長(zhǎng)環(huán)境突然改變，均使應(yīng)激因素增加，導(dǎo)致豬群抵抗力下降，將會(huì)引起發(fā)病。因此，最好是堅(jiān)持“自繁自養(yǎng)”，是預(yù)防本病發(fā)生的重要措施之一。在引進(jìn)時(shí)應(yīng)確保不從疫區(qū)引進(jìn)生豬，保證引進(jìn)健康的豬。購(gòu)回后不要急于混群，應(yīng)隔離一段時(shí)間，確定健康后再混群飼養(yǎng)。

臨床上，副豬嗜血桿菌常發(fā)生于豬其他疾病，如豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型等疫病。平時(shí)應(yīng)做好對(duì)其他疾病的免疫，以防繼發(fā)感染。豬發(fā)病后要早診斷、早治療，采取綜合防治措施，使疫情盡快得到控制，減少不必要的經(jīng)濟(jì)損失。

在本試驗(yàn)中，根據(jù)發(fā)病情況、臨床癥狀、剖檢變化，以及細(xì)菌培養(yǎng)和 PCR 鑒定進(jìn)行綜合診斷，確診為副豬嗜血桿菌病。在該病的防治上，一般在臨床上都采用疫苗注射和抗菌素治療，由于大量使用抗菌素，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生，使該病的預(yù)防和治療表現(xiàn)更加困難。本試驗(yàn)對(duì)多種抗菌素藥物的耐藥性進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示流行菌株對(duì)多種藥物已產(chǎn)生耐藥性，如丁胺卡那霉素、新霉素、頭孢芐胺、鏈霉素、多粘菌素、復(fù)方新諾明等；僅對(duì)比較少數(shù)藥物較敏感，如頭孢噻呋、氟苯尼考、阿莫西林等。在防治副豬嗜血桿菌病時(shí)，建議應(yīng)以疫苗為主，可根據(jù)藥敏試驗(yàn)進(jìn)行交叉使用抗菌素，并配合中藥制劑效果會(huì)更好。

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10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.014