張?chǎng)?，李愛軍＊，周鑫，肖琎，劉洋，杜瑞煥，齊彪，張立田，項(xiàng)愛麗，段曉然

（1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心 河北唐山 063000；2.唐山市機(jī)構(gòu)編制電子政務(wù)中心 河北唐山 063000）

高效液相色譜法測(cè)定禽蛋中蘇丹紅染料的方法研究

張?chǎng)?，李愛軍1＊，周鑫1，肖琎1，劉洋1，杜瑞煥1，齊彪2，張立田1，項(xiàng)愛麗1，段曉然1

（1.唐山市畜牧水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測(cè)中心 河北唐山 063000；2.唐山市機(jī)構(gòu)編制電子政務(wù)中心 河北唐山 063000）

本實(shí)驗(yàn)建立了禽蛋中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ殘留測(cè)定的高效液相色譜法，樣品經(jīng)正己烷提取濃縮

禽蛋；蘇丹紅染料；高效液相色譜法；固相萃取

蘇丹紅系列染料是一組人工合成的以苯基偶氮萘酚為主要 基 團(tuán)的親 脂 性偶氮 化 合物[1]，蘇丹 紅 I化學(xué)名 1- 苯基偶氮 -2- 萘酚，蘇丹紅 II化學(xué)名稱為 1-[（2,4- 二甲基苯）偶氮]-2- 萘酚，蘇丹 III 化學(xué)名稱為 1-[4-(苯基偶氮)苯基]偶氮 -2- 萘酚，蘇丹紅 IV 化學(xué)名稱 1-2- 甲基 -4-[（2- 甲基苯）偶氮]苯基偶氮 -2- 萘酚。因?yàn)槠漉r艷的顏色且不易褪色，經(jīng)常被不法分子作為染色劑添加進(jìn)食品中。蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及其代謝產(chǎn)物有致癌性 ,因此我國在已經(jīng)明 令 禁止 在 食品中 應(yīng)用[2]。 但 仍有 一些 不法 分子在利益的驅(qū)使下，將蘇丹紅染料加入飼料中喂養(yǎng)家禽，以期得到所謂“紅黃蛋”。國家已經(jīng)出臺(tái)針對(duì)食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn) GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》[3]。但是國標(biāo)規(guī)定的方法操作復(fù)雜，對(duì)檢測(cè)人員要求較高，并不適用于大量樣品的檢測(cè)。本文利用高效液相色譜法儀，建立了針對(duì)禽蛋中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ檢測(cè)的方法。本方法具有提取過程簡(jiǎn)單快捷，凈化效果好，回收率高等特點(diǎn)，適用于禽蛋中蘇丹紅染料的檢測(cè)。

1材料和方法

1.1 儀器

高效液相色譜儀，島津公司 LC-20AT 配紫外檢測(cè)器；電子天平，Sartorius 公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試劑

正己烷，HPLC 級(jí)，ACS 公司；乙腈，HPLC 級(jí)，ACS 公司；丙酮，HPLC 級(jí)，ACS 公司；蘇丹紅Ⅰ、蘇丹紅Ⅱ、蘇丹紅Ⅲ、蘇丹紅Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品，Dr.E；500mg/6 mL中性氧化鋁固相萃取小柱，迪馬科技。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 色譜條件 色譜柱為 LUNA C18 250mm×4.6 mm 5μm，流速為 1.0m L/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為 478 nm，蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為 520 nm。

色譜分離采用梯度洗脫的方式。流動(dòng)相：溶劑 A為 0.1%甲酸水溶液∶乙腈為 85∶15，溶劑 B 為0.1%甲酸乙腈溶液∶丙酮為 80∶20。梯度條件：0～9min，流動(dòng)相 A 保持 25%；9.01～20min，流動(dòng)相 A從 25%下降到 0；20.01～25min，流動(dòng)相 A 保持不變；25.01～30min，流動(dòng)相 A 保持 25%。

1.4 樣品處理：

稱取 5 g 樣品至50mL 離心管中，加入 15m L 正己烷，振蕩 10min，5 000 r/min 離心 5min，收集上清液，重復(fù)提取1 次，合并2 次上清液，45 ℃減壓旋蒸至干，用 5mL 正己烷溶解，備用。中性氧化鋁固相萃取柱用 5m L 正己烷活化，5mL 溶解液全部過柱，10 mL 正己烷淋洗，5mL 5%丙酮正己烷溶液洗脫，氮吹至干，2mL 丙酮復(fù)溶，過 0.45μm 濾膜上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 最佳波長(zhǎng)的測(cè)定

分別取蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)標(biāo)準(zhǔn)溶液于190～600 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ號(hào)最大吸收波長(zhǎng)接近，蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號(hào)最大吸收波長(zhǎng)接近，故而選擇蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為 478 nm，蘇丹紅Ⅲ、Ⅳ號(hào)檢測(cè)波長(zhǎng)為 520 nm。

2.2 提取溶劑選擇

根據(jù)禽蛋類樣品特點(diǎn)及文獻(xiàn)[4-6]中提取方法，對(duì)正己烷、乙腈、正己烷 - 丙酮溶液三種提取液進(jìn)行了比較，結(jié)果表明正己烷提取液和正己烷 -丙酮提取液提取回收率均比乙腈提取液高，且二者回收率相近，所以選擇用正己烷做提取液。

2.3 固相萃取柱的選擇和凈化條件的確定

國標(biāo) GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》中使用中性氧化鋁固相萃取柱對(duì)樣品進(jìn)行凈化，但是國標(biāo)中的中性氧化鋁固相萃取柱手工填裝，不容易把握填裝量，氧化鋁的活度也難以掌控，這直接影響檢測(cè)結(jié)果。本方法對(duì)不同填料量的市售中性氧化鋁固相萃取柱進(jìn)行了比較，并且根據(jù)樣品濃縮后復(fù)溶液體積為 5mL，所以最終選擇 500mg/6mL 的中性氧化鋁固相萃取柱。

圖1 蘇丹紅混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖2 空白加標(biāo)色譜圖

圖3 空白樣品色譜圖

中性氧化鋁固相萃取柱的屬于正相柱，選擇了丙酮 -正己烷溶液作為洗脫液，并且根據(jù)丙酮濃度做了淋洗曲線，發(fā)現(xiàn) 5%丙酮正己烷溶液（體積比）就能完全洗脫蘇丹紅，所以選擇了 5%丙酮正己烷溶液（體積比）作為洗脫液。

圖4 淋洗曲線

2.4 線性范圍及最低檢測(cè)限

配 制 濃 度 分 別 為 0μg/mL、0.1μg/mL、0.5 μg/m L、1.0 μg/mL、5.0 μg/m L、10.0 μg/mL 蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行色譜分析，以蘇丹紅含量 Y（μg/mL）對(duì)峰面積 X 作圖，得出蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 蘇丹紅的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

2.5 方法測(cè)定低限的確定

對(duì)空白樣品進(jìn)行 20 次重復(fù)測(cè)定，按照 3 倍信噪比計(jì)算，得出方法測(cè)定低限均為 10μg/kg。

2.6 精密度回收率

對(duì)加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)濃度分別為 10μg/kg、20μg/kg、100μg/kg，即為方法測(cè)定低限、兩倍方法測(cè)定低限和十倍方法測(cè)定低限，依照樣品處理方法測(cè)定，回收率及相對(duì)偏差見表。從表可見，3 個(gè)加標(biāo)濃度的蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)均有良好回收率和相對(duì)偏差。

表2 蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)的加標(biāo)回收率和相對(duì)偏差

3 小結(jié)

本方法對(duì)禽蛋中蘇丹紅Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ號(hào)的檢測(cè)方法進(jìn)行了研究，通過對(duì)提取液、固相萃取條件的優(yōu)化，得到了滿意的分離效果。本方法具有操作簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，線性范圍寬等特點(diǎn)，完全能夠滿足禽蛋中蘇丹紅染料檢測(cè)的需要。

[1]黃曙海等. 蘇丹紅染料毒性研究及食品中蘇丹紅檢測(cè)方法簡(jiǎn)述[J].廣西預(yù)防醫(yī)學(xué),2005(11):380-383.

[2] (5)衛(wèi)生部.中華人民共和國衛(wèi)生部公告,蘇丹紅危險(xiǎn)性評(píng)估報(bào)告[R].2015.

[3]國 家質(zhì) 量 監(jiān) 督 檢 驗(yàn) 檢 疫 總 局, 國 家 標(biāo) 準(zhǔn) 化 管 理 委 員 會(huì).GB/T 19681-2005. 食品中蘇丹紅染料的檢測(cè)方法高效液相色譜法[S].2005-03-29

[4]吳銀良等,固相萃取高效液相色譜法測(cè)定辣椒油中蘇丹紅和對(duì)位紅染料.食品科學(xué)，2009(30):243-246.

[5]金海濤等, 高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中蘇丹紅的檢測(cè)方法.現(xiàn)代科學(xué)儀器，2009(6):101-103

[6]馮輝等, 固相萃取 - 高效液相色譜法測(cè)定雞蛋中蘇丹紅染料.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015(14):291-293.

（配圖來自網(wǎng)絡(luò)）

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.02.043

*通訊作者：李愛軍。

張?chǎng)危?983-），女，河北唐山人，碩士研究生，從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)研究。

后，用中性氧化鋁固相萃取柱凈化，高效液相色譜分離測(cè)定。四種蘇丹紅染料濃度在 0～10μg/m L 范圍內(nèi)與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均在 0．9998 以上。低、中、高 3 個(gè)加標(biāo)水平的回收率在 73．04%～96．79%之間，相對(duì)偏差為 0．98%～5．89%。本方法操作簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，線性范圍寬，適用于禽蛋中蘇丹紅染料檢測(cè)。