王善青 周曉農(nóng)

1 制定《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》的意義和必要性

血涂片染色法檢測技術(shù)是目前國內(nèi)外通用的最直接、最重要的瘧原蟲檢測方法和瘧疾病例確診依據(jù)。血涂片鏡檢法既是世界衛(wèi)生組織推薦的瘧原蟲檢測金標(biāo)準(zhǔn)，也是我國瘧疾診斷標(biāo)準(zhǔn)中推薦的主要檢測技術(shù)。世衛(wèi)組織建議，在進(jìn)行抗瘧治療之前，要對所有瘧疾疑似患者通過顯微鏡或者瘧疾快速診斷檢測法（RDT）及時(shí)作出寄生蟲學(xué)診斷[1]。光學(xué)顯微鏡要求在患者血液的厚涂片或者薄涂片中看到瘧原蟲。2016年6月1日起實(shí)施的《瘧疾的診斷》標(biāo)準(zhǔn)（WS-259-2015）中，在實(shí)驗(yàn)室檢查中的第一條就是顯微鏡檢查血涂片查見瘧原蟲[2]。目前，國內(nèi)外檢測瘧原蟲的主要方法就是“血涂片染色鏡檢法”。通過鏡檢方法檢測的瘧疾患者數(shù)量在2014年全球上升到2.03億。印度在這一全球總量中占據(jù)主導(dǎo)，所做的載玻片檢查達(dá)到1.2億份以上。在非洲區(qū)域，通過顯微鏡得到檢查的患者人數(shù)由2010年的3 300萬增加到2014年4 800萬[3]。鏡檢診斷檢測可加強(qiáng)對發(fā)熱患者中瘧疾患者的篩查和管理，也可能有助于通過僅在確診患者身上使用抗瘧疾藥而減輕耐藥性的出現(xiàn)和擴(kuò)散。

血涂片染色后用顯微鏡檢測瘧原蟲是我國基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)和疾控部門最直接也是最常用的檢測方法[4]。血涂片顯微鏡檢查瘧原蟲是醫(yī)學(xué)上一種比較常見的方法，并且這種方法在對瘧原蟲的檢查上運(yùn)用的非常廣泛，對于瘧疾患者的及時(shí)診斷有著很大的臨床價(jià)值。血涂片鏡檢瘧原蟲也是檢驗(yàn)科的基本技能之一[5]。由于我國目前對于顯微鏡血涂片檢測瘧原蟲技術(shù)只有指南，而沒有規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)。各地在實(shí)際操作過程中很難做到統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，基層醫(yī)療衛(wèi)生工作者在開展顯微鏡血涂片法檢測瘧原蟲時(shí)隨意性很大，血涂片的制作既不規(guī)范也不統(tǒng)一。近年來，由于我國本地瘧疾病例的減少和消除，導(dǎo)致許多基層醫(yī)院和疾控機(jī)構(gòu)不再重視瘧疾血涂片的鏡檢工作，使好多年輕的檢驗(yàn)工作者不會制作血涂片，不認(rèn)識瘧原蟲，導(dǎo)致基層檢測人員的血涂片鏡檢水平不斷下降[6-8]，甚至各級疾控機(jī)構(gòu)鏡檢人員瘧原蟲監(jiān)測檢測能力和意識也有所下降，這將會導(dǎo)致部分瘧疾患者漏診和誤診[9]，因?yàn)榀懠驳脑缙跍?zhǔn)確診斷對于有效的疾病管理和瘧疾監(jiān)測至關(guān)重要，如果沒有規(guī)范的顯微鏡血涂片法檢測瘧原蟲技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，將直接影響到目前我國正在開展的消除瘧疾工作中的病例診斷和發(fā)熱患者的監(jiān)測。因?yàn)檎`診會引起大量發(fā)病和死亡，高質(zhì)量的瘧疾診斷在各種情況下都很關(guān)鍵。因此，制定《瘧原蟲檢測 血涂片鏡檢法》這一標(biāo)準(zhǔn)，是為我國各級醫(yī)療機(jī)構(gòu)從事臨床瘧疾病原學(xué)檢驗(yàn)人員和疾控機(jī)構(gòu)從事瘧疾監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室人員提供一個(gè)統(tǒng)一規(guī)范的操作流程和技術(shù)規(guī)范。該標(biāo)準(zhǔn)的制訂對我國消除瘧疾以及消除瘧疾后的監(jiān)測工作具有十分重要的意義。鏡檢瘧原蟲仍是目前瘧疾診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，是發(fā)現(xiàn)瘧疾病原的主要手段，也是當(dāng)前防治和消除瘧疾工作中的關(guān)鍵技術(shù)之一[10]。2010年，原衛(wèi)生部等13部委聯(lián)合印發(fā)了《中國消除瘧疾行動(dòng)計(jì)劃2010-2020》[11]，確定了到2020年全國實(shí)現(xiàn)消除瘧疾的目標(biāo)，并對各級疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)開展瘧原蟲血檢比例、實(shí)驗(yàn)室檢測率和實(shí)驗(yàn)室確診比例等指標(biāo)作了明確規(guī)定。為進(jìn)一步提高全國疾控機(jī)構(gòu)專業(yè)技術(shù)人員寄生蟲病防治理論水平與檢測技能，提高各地重點(diǎn)和常見寄生蟲病防治能力，國家衛(wèi)生計(jì)生委疾控局每年都要舉辦全國寄生蟲病防治技術(shù)競賽，其中一項(xiàng)重要內(nèi)容就是血涂片制作、染色及鏡檢操作等技能。有了標(biāo)準(zhǔn)，全國就有了統(tǒng)一的規(guī)范和要求，對人員培訓(xùn)、考核與評價(jià)也就有了依據(jù)。

2 血涂片鏡檢法檢測瘧原蟲的優(yōu)勢與條件

光學(xué)顯微鏡的優(yōu)點(diǎn)是在患者血液的厚涂片或者薄涂片中可以直接看到瘧原蟲。顯微鏡使人能夠辨認(rèn)不同的致瘧寄生蟲（惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲和卵形瘧原蟲）、寄生蟲不同時(shí)期（包括配子體），以及對寄生蟲密度進(jìn)行定量，以監(jiān)測治療效果。顯微鏡是對瘧疾治療失敗情況作出調(diào)查的首選方法。吉姆薩染色是顯微鏡檢測瘧原蟲所用的傳統(tǒng)染色方法，要對同一患者的薄血膜和厚血膜進(jìn)行檢查才可做出診斷。血涂片鏡檢法是從傳統(tǒng)角度對其它診斷方法進(jìn)行衡量的診斷標(biāo)準(zhǔn)，所以說目前仍然是瘧疾診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

對瘧疾實(shí)行寄生蟲學(xué)診斷檢測可以加強(qiáng)對發(fā)熱疾病患者的管理，特別是有助于發(fā)現(xiàn)需要不同治療方法的非瘧疾患者。使用這種檢查方法可以僅在確診患者身上使用抗瘧藥，從而有助于減少耐藥性的出現(xiàn)和擴(kuò)散。寄生蟲學(xué)診斷的優(yōu)勢取決于醫(yī)療機(jī)構(gòu)是否在管理患者時(shí)遵循檢查結(jié)果。在可以及時(shí)進(jìn)行高質(zhì)量的寄生蟲學(xué)診斷，而且沒有嚴(yán)重疾病征兆時(shí)，抗瘧藥治療應(yīng)該僅限于檢查結(jié)果呈陽性的病例，而陰性病例則考慮其它發(fā)熱病因。

雖然顯微鏡仍然是多數(shù)大型醫(yī)療診所和醫(yī)院作出寄生蟲學(xué)診斷的支柱，但顯微鏡診斷的質(zhì)量常常在確保瘧疾診斷的良好敏感性和特異性方面存在不足，這對健康結(jié)果和最佳治療方案帶來了負(fù)面影響?？山邮艿娘@微鏡檢測應(yīng)該既符合成本效益，又可以一直得出準(zhǔn)確并且足夠及時(shí)的結(jié)果，以對治療帶來直接影響。這就需要有全面并且運(yùn)作良好的質(zhì)量保證規(guī)劃[3]。瘧疾鏡檢方面的有效質(zhì)量管理體系要求有：（1）對質(zhì)量保證進(jìn)行監(jiān)督的中央?yún)f(xié)調(diào)員；（2）在國家級和省級層面有一支顯微鏡學(xué)家參考（核心）小組，并得到外部質(zhì)量保證規(guī)劃的支持以及得到培訓(xùn)和載玻片驗(yàn)證方面的專門技能；（3）根據(jù)相關(guān)臨床機(jī)構(gòu)所需能力建立起良好培訓(xùn)系統(tǒng)；（4）定期開展再培訓(xùn)并對能力進(jìn)行評估/分級，同時(shí)得到經(jīng)過驗(yàn)證的參比成套載玻片（瘧疾載玻片銀行）的支持；（5）可持續(xù)的載玻片驗(yàn)證系統(tǒng)，可利用良好的驗(yàn)證結(jié)果來發(fā)現(xiàn)存在的總體不足，并具有一個(gè)解決績效不足問題的系統(tǒng)；（6）在所有層面實(shí)施良好監(jiān)督；（7）對顯微鏡進(jìn)行良好的供應(yīng)管理和維護(hù)；（8）在所有層面具有清晰的標(biāo)準(zhǔn)操作程序；（9）將預(yù)算列入瘧疾病例管理資金并使其保持充足。

3 世界衛(wèi)生組織的相關(guān)文件和手冊指南

世衛(wèi)組織要求所有疑似瘧疾患者在接受抗瘧藥物治療前，應(yīng)先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢查（顯微鏡血涂片檢查或瘧疾快速診斷試劑檢測）。世界衛(wèi)生組織（WHO）在2010年出版的《瘧疾治療指南》（Guidelines for the treatment of malaria, Second edition，WHO，2010）中明確指出，血涂片染色法檢測瘧原蟲是瘧疾診斷基本方法[12]，在2013年版《普及瘧疾診斷檢測-操作手冊》（Universal access to malaria diagnostic testing：an operational manual，WHO，2011，rev.2013）中，不但將顯微鏡血涂片染色法檢測瘧原蟲列為兩個(gè)基本診斷檢測方法之一（另一個(gè)是RDT），而且還列出了顯微鏡的使用、維護(hù)與保養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程[13]。雖然RDT越來越多地用于瘧疾的診斷，特別是在沒有鏡檢能力的偏遠(yuǎn)山區(qū)，但是，由于顯微鏡血涂片染色法檢測瘧原蟲具有直接成本低、能區(qū)分多種種型和計(jì)算原蟲密度等獨(dú)特優(yōu)勢，RDT是無法取代的，由此，WHO和世界各國目前仍推薦顯微鏡血涂片染色法檢測瘧原蟲為瘧疾診斷檢測的基本方法，特別在消除瘧疾階段，WHO推薦顯微鏡血涂片檢測是發(fā)現(xiàn)病例的主要手段，并于2014年3月在日內(nèi)瓦召開了“全球瘧疾項(xiàng)目專家咨詢會”專門討論了瘧疾鏡檢質(zhì)量保證手冊的更新問題[14]，2015年又出臺了厚薄血膜用于瘧原蟲的發(fā)現(xiàn)、診斷和計(jì)數(shù)的顯微鏡使用手冊[15]，指導(dǎo)世界各地瘧疾流行區(qū)的瘧原蟲顯微鏡檢測工作。

4 血涂片鏡檢在檢驗(yàn)人員全面素質(zhì)培訓(xùn)中的重要性

隨著各類儀器在檢驗(yàn)工作中的應(yīng)用，儀器操作簡便、準(zhǔn)確度高、誤差小等優(yōu)點(diǎn)越來越被廣大檢驗(yàn)工作者所青睞，也越來越依賴這些儀器。再加上現(xiàn)在工作量大，費(fèi)時(shí)、費(fèi)力的各種手工操作技術(shù)被忽略，而血涂片鏡檢就是各種手工操作技術(shù)中最基礎(chǔ)的一項(xiàng)，也是考察檢驗(yàn)工作者全面素質(zhì)最標(biāo)準(zhǔn)的一項(xiàng)。而這些手工操作技術(shù)是很多儀器不能代替的，并且在其它血液檢測標(biāo)本預(yù)處理時(shí)也用的上[16]。為了加強(qiáng)血涂片鏡檢等檢驗(yàn)基本操作技術(shù)，國家每年組織一次全國寄生蟲基本操作技能比賽，引導(dǎo)著全國各地從事寄生蟲檢驗(yàn)（包括瘧原蟲檢測）的人員學(xué)習(xí)推片、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、觀察各種寄生蟲的形態(tài)等，使許多年輕同志熟練掌握了血涂片鏡檢的各種操作技術(shù)，提升了檢測人員的全面素質(zhì)。由于各類儀器的局限性，均不能對瘧原蟲的形態(tài)、分類及蟲種等作出辨認(rèn)，只能作為一種初篩手段。而血涂片鏡檢由于是在顯微鏡下直觀觀察，能提高對瘧疾的診斷準(zhǔn)確度，更好地服務(wù)于臨床，服務(wù)于患者。各級醫(yī)院應(yīng)高度重視血涂片鏡檢工作，制定完善的制度。同時(shí)做好檢驗(yàn)工作者全面素質(zhì)的培訓(xùn)，提高檢驗(yàn)工作者服務(wù)于臨床的基本操作技能[17]。

5 對可能引起誤解的指標(biāo)的解釋

（1） 厚血膜的直徑應(yīng)為0.8～1 cm 還是1～1.2 cm，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的是直徑0.8～1 cm，主要依據(jù)一是2015年11月16日發(fā)布的《瘧疾的診斷》（WS259-2015）規(guī)范性附錄中已有明確要求，二是現(xiàn)場調(diào)研時(shí)征求了縣鄉(xiāng)兩級瘧疾檢驗(yàn)人員的意見，認(rèn)為直徑0.8～1 cm的厚血膜是合適的。

（2） 厚血膜一天內(nèi)染色無需溶血,“一天”是否應(yīng)改為“24小時(shí)”，經(jīng)專家會議討論和現(xiàn)場調(diào)研了解，大家一致認(rèn)為厚血膜溶血雖然有時(shí)間要求，但是不用精確到小時(shí)，為了便于基層人員掌握，以“一天”的描述方式較為合適。

（3）制作薄血膜時(shí)，載玻片與推片保持25°～35°角還是30°～45°角推開血膜，本標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的是載玻片與推片保持25°～35°，主要依據(jù)一是2015年11月16日發(fā)布的《瘧疾的診斷》（WS259-2015）規(guī)范性附錄中已有明確要求，二是現(xiàn)場調(diào)研時(shí)征求了縣鄉(xiāng)兩級瘧疾檢驗(yàn)人員的意見，認(rèn)為載玻片與推片保持25°～35°是合適的。

（4）關(guān)于是否要增加“諾氏瘧原蟲”這個(gè)問題，起草組專家進(jìn)行了認(rèn)真的討論，最后一致認(rèn)為，盡管目前國外（特別是馬來西亞和一些東南亞國家）有不少人感染“諾氏瘧原蟲”的報(bào)道，國內(nèi)也有檢測到個(gè)別“諾氏瘧原蟲”感染病例，但是，目前國際社會仍以四種人體寄生蟲為主，尚未把“諾氏瘧原蟲”正式納入，另外，本標(biāo)準(zhǔn)在術(shù)語的定義中表述的已經(jīng)比較清楚，將其納入“等”的范圍。