張慧芹，李 穎，許永根

(1.北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科中心，北京 10091;2.滄州市中心醫(yī)院眼一科，滄州 061000)

實(shí)驗(yàn)性干眼大鼠的角結(jié)膜上皮組織學(xué)改變

張慧芹1，2，李 穎1，許永根1

(1.北京大學(xué)第三醫(yī)院眼科中心，北京 10091;2.滄州市中心醫(yī)院眼一科，滄州 061000)

目的建立大鼠干眼模型并進(jìn)行評(píng)價(jià)，比較正常大鼠和干眼大鼠角結(jié)膜上皮組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。方法采用苯扎氯銨滴眼誘導(dǎo)大鼠出現(xiàn)干眼，麻醉后處死動(dòng)物，取正常大鼠和干眼大鼠角結(jié)膜組織行HE染色，及電鏡下觀察大鼠角結(jié)膜超微結(jié)構(gòu)。結(jié)果干眼大鼠角膜上皮和結(jié)膜上皮出現(xiàn)上皮細(xì)胞缺失，結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞減少，電鏡下觀察干眼大鼠角膜結(jié)膜上皮細(xì)胞微絨毛缺失，斷裂，出現(xiàn)基底膜溶解，細(xì)胞內(nèi)線粒體溶解。結(jié)論苯扎氯銨誘導(dǎo)的大鼠干眼模型與人干眼發(fā)生后角膜結(jié)膜發(fā)生的改變相似，此干眼模型在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中具有重要的參考價(jià)值。

干眼，苯扎氯銨，上皮細(xì)胞，超微結(jié)構(gòu)

干眼是一種多因素造成的眼表及淚液異常的疾病，可導(dǎo)致眼部不適和視力下降，破壞淚膜穩(wěn)定性進(jìn)而造成眼表的損害，并伴有淚液滲透壓升高和眼表炎癥反應(yīng)［1］。動(dòng)物模型是進(jìn)行臨床研究和基礎(chǔ)研究的重要載體，直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，根據(jù)不同的發(fā)病機(jī)制建立合適的動(dòng)物模型是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)。目前通常根據(jù)干眼發(fā)病的假定原因建立干眼動(dòng)物模型，如維生素A缺乏、藥物作用、改變動(dòng)物性激素水平、手術(shù)摘除淚腺等［2，3］，研究干眼的發(fā)病機(jī)制和治療方法。

苯扎氯銨是滴眼液中最常用的防腐劑［4］，它可破壞淚膜，損傷角、結(jié)膜上皮和細(xì)胞間連接蛋白，損傷杯狀細(xì)胞分泌功能，誘發(fā)眼表炎癥等［3］。苯扎氯銨制造干眼模型對(duì)干眼的發(fā)病因素不能進(jìn)行準(zhǔn)確的單因素模仿，但苯扎氯銨作用的復(fù)雜性可用于解釋淚膜異常進(jìn)而導(dǎo)致干眼的重要機(jī)制。苯扎氯銨誘導(dǎo)的大鼠干眼模型，臨床表現(xiàn)及病理變化類似人干眼的發(fā)生過程且模型穩(wěn)定。因此，我們采用了苯扎氯銨誘導(dǎo)大鼠干眼模型。

本研究擬通過苯扎氯銨誘導(dǎo)干眼建立淚膜異常型大鼠干眼模型，進(jìn)而對(duì)其發(fā)生的病理學(xué)改變進(jìn)行觀察，分析該方法作為干眼研究動(dòng)物模型的科學(xué)性，為應(yīng)用此模型探討淚膜穩(wěn)定性與干眼發(fā)生機(jī)制的關(guān)系提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:6周齡 SPF級(jí) SD雄性大鼠20只，無眼部疾病，體重(220±5)g，均購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2011-0012］，飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部［SYXK(京)2011-0039］。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的喂養(yǎng)和使用遵循國(guó)家科學(xué)技術(shù)部頒布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給與人道關(guān)懷。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝取食水。

1.1.2 藥品與試劑:苯扎氯銨(美國(guó)Sigma公司)，淚液試紙條(天津晶明醫(yī)用器材公司);熒光素鈉試紙(天津晶明醫(yī)用器材公司)，HE染料(美國(guó)Sigma公司)，PAS染料(北京天合利恩化學(xué)試劑公司)。

1.1.3 主要儀器:體式顯微鏡(德國(guó) Leica公司);光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司);JEM-1400透射電子電鏡(北京交通大學(xué)提供);裂隙燈顯微鏡眼前節(jié)照相系統(tǒng)(日本Topcon公司)

1.2 方法

1.2.1 苯扎氯銨誘導(dǎo)大鼠干眼模型的建立:使用0.3%苯扎氯銨滴至SD大鼠左眼［3］，5 μL/次，3次/ d，連續(xù)7 d。右眼不做任何處理，作為正常對(duì)照。

1.2.2 大鼠干眼臨床評(píng)估:正常大鼠在實(shí)驗(yàn)開始前腹腔注射麻醉后進(jìn)行淚膜破裂時(shí)間(BUT)，Schirmer實(shí)驗(yàn)I(Schirmer I test，SIt)，角膜熒光素鈉染色檢查，裂隙燈顯微鏡觀察大鼠眼表。在滴加苯扎氯銨7 d后再次行左眼BUT，SIt，角膜熒光素鈉染色評(píng)分。所有檢查由同一個(gè)人完成。檢查前將淚液試紙條修剪成1 mm ×35 mm大小，大鼠腹腔注射鹽酸氯胺酮和鹽酸賽拉嗪混合液(1.5 mL/kg體重)。全身麻醉后，將濾紙頭端折疊2.5 mm，置于下眼瞼結(jié)膜囊內(nèi)側(cè)1/3處，其余部分懸垂于皮膚表面，閉合大鼠眼睛，5 min后測(cè)量濾紙被滲濕的長(zhǎng)度(不包括反折處)［5］。將3 μL的1%的熒光素鈉滴至結(jié)膜囊，使大鼠眼睛閉合，在裂隙燈顯微鏡(Topcon. Japan，PS-75E)鈷藍(lán)光下觀察，3次瞬目后，以最后一次瞬目至角膜出現(xiàn)第一個(gè)黑斑的時(shí)間為BUT，觀察3次取平均值。角膜熒光素鈉染色評(píng)分:結(jié)膜囊內(nèi)滴入熒光素鈉2 min后，在裂隙燈顯微鏡鈷藍(lán)光下進(jìn)行角膜上皮熒光素鈉染色分級(jí)。角膜平均分成4個(gè)象限，各自評(píng)分，然后相加。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［6］:無染色，0分。點(diǎn)狀染色少于30個(gè)，1分。多于30個(gè)但不彌散，2分。彌散染色但無斑塊狀染色，3分。斑塊狀染色，4分。將20只大鼠的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選出指標(biāo)在均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)范圍內(nèi)最接近指標(biāo)均值的大鼠進(jìn)入后續(xù)實(shí)驗(yàn)，采用隨機(jī)數(shù)字表法進(jìn)行分組。

1.2.3 取材:臨床指標(biāo)檢測(cè)后，安樂死處死動(dòng)物。各組隨機(jī)選取3只，立即摘除眼球，快速分離角膜，結(jié)膜，4%多聚甲醛或2.5%戊二醛固定，備用。

1.2.4 組織病理學(xué)檢查:處死動(dòng)物后立即摘除眼球，體積分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定，梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm厚切片、行蘇木精-伊紅染色或高碘酸-希夫試劑染色、封片，顯微鏡觀察。

1.2.5 透射電鏡檢查:處死動(dòng)物后立即摘除眼球，2.5%戊二醛固定2 h，1%鋨酸固定，梯度酒精脫水，樹脂包埋，超薄切片，JEM-1400電鏡觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析本研究檢測(cè)指標(biāo)的數(shù)據(jù)資料經(jīng)w檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以±s表示。采用完全隨機(jī)分組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，單因素干預(yù)多水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，正常對(duì)照組、干眼模型組淚液分泌量，BUT和角膜熒光素鈉染色評(píng)分總體差異比較采用單因素方差分析。采用雙尾檢測(cè)法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量分析

對(duì)20只大鼠的各項(xiàng)臨床指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，將各項(xiàng)臨床指標(biāo)在±s范圍內(nèi)的大鼠共16只入選造模實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為兩組:正常組和模型組。將模型組大鼠的各項(xiàng)臨床指標(biāo)在±s范圍內(nèi)的大鼠進(jìn)行后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

2.2 大鼠干眼相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)

正常大鼠淚膜破裂時(shí)間 ＞10 s，苯扎氯銨造模后淚膜破裂時(shí)間明顯縮短。裂隙燈顯微鏡下觀察正常大鼠，角、結(jié)膜光滑，角膜無水腫，結(jié)膜無充血，角膜熒光素鈉染色呈陰性。造模后，出現(xiàn)角膜水腫結(jié)膜充血，角膜熒光素鈉染色陽(yáng)性。正常大鼠淚液分泌量＞4.5 mm，苯扎氯銨誘導(dǎo)干眼后明顯縮短，淚液分泌量減少。兩組大鼠干眼相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖1，2)。

圖1 大鼠干眼相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)Fig.1 Related indicators of rat dry eye

2.3 HE染色結(jié)果分析

光鏡下觀察角、結(jié)膜組織結(jié)構(gòu)。正常角膜由2～3層鱗狀上皮細(xì)胞，排列整齊均勻;上皮光滑完整，無水腫及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)膜由2～7層非角化鱗狀柱狀上皮細(xì)胞組成，形態(tài)規(guī)則完整細(xì)胞排列緊密，可見散在分布的杯狀細(xì)胞，上皮表面平滑。模型組:角膜結(jié)膜上皮出現(xiàn)缺損，可見細(xì)胞浸潤(rùn)，角膜結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)異常，排列紊亂，結(jié)膜上皮杯狀細(xì)胞明顯減少，分布稀疏。角膜基質(zhì)層水腫，結(jié)膜固有層可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3)。

2.4 結(jié)膜PAS染色

正常結(jié)膜組織可見較多的散在杯狀細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)飽滿，呈開口向外的杯狀，PAS染色陽(yáng)性，絳紅色，每組取6張不同等分位置的切片分別計(jì)數(shù)，取其平均值為該眼的杯狀細(xì)胞數(shù)量。正常組大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞的數(shù)量為(84±10.57)個(gè)，模型建立后杯狀細(xì)胞的數(shù)量下降為(48±16.92)個(gè)，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4)。

2.5 透射顯微鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變

透射顯微鏡觀察角結(jié)膜上皮超微結(jié)構(gòu)，正常上皮表層細(xì)胞微絨毛豐富，呈指狀突起，經(jīng)過苯扎氯銨作用后，上皮細(xì)胞的微絨毛和微皺襞腫脹，融合、卷曲斷裂、脫落，干眼大鼠角膜結(jié)膜淺表2～3層上皮細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)卷曲樣剝脫，呈游離的葉片狀或索條狀。干眼大鼠角結(jié)膜上皮淺層部分橋粒連接分離，細(xì)胞間連接斷裂，角膜基底層細(xì)胞間橋粒及半橋粒連接明顯異常。上皮細(xì)胞內(nèi)線粒體出現(xiàn)空泡，溶解。正常大鼠結(jié)膜杯狀細(xì)胞形態(tài)飽滿，功能正常，干眼發(fā)生后整個(gè)結(jié)膜上皮結(jié)膜杯狀細(xì)胞幾乎消失(圖5，6)。

3 討論

干眼是眼科常見的疾病之一，為了便于對(duì)干眼的研究，目前干眼研究領(lǐng)域有多種建立干眼動(dòng)物模型的方法。苯扎氯銨可以破壞眼表上皮細(xì)胞的緊密連接［7，8］，損害角膜上皮細(xì)胞的功能［9，10］，進(jìn)而影響角膜淚膜穩(wěn)定性，從而使眼表平衡狀態(tài)異常［9，11，12］。苯扎氯銨還可以造成結(jié)膜上鱗狀化生，結(jié)膜基質(zhì)層炎細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞凋亡［9，10，13］，使杯狀細(xì)胞數(shù)量減少［14-16］，這些病理改變類似干眼發(fā)生的晚期病理改變。近年來的干眼研究通常采用苯扎氯銨滴眼誘導(dǎo)干眼模型的建立［3］。在本實(shí)驗(yàn)苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼模型中，干眼相關(guān)臨床評(píng)估指標(biāo)BUT，SIt，角膜熒光素鈉染色評(píng)分異常，組織病理檢查發(fā)現(xiàn)角、結(jié)膜上皮層數(shù)均有不同程度減少，細(xì)胞腫脹，形態(tài)變異，部分結(jié)膜杯狀細(xì)胞丟失、破壞，很好地模擬了干眼引起的眼表組織病理生理改變，說明此方法可以成功建立干眼模型同時(shí)模擬干眼發(fā)生后眼表的生理病理改變。實(shí)驗(yàn)過程中選用了大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，由于雖然兔眼球體積大，性格溫順，可直接觀察到熒光素染色、虎紅染色、Schiemer試驗(yàn)等各項(xiàng)淚液學(xué)指標(biāo)的變化，是常用的干眼動(dòng)物模型之一，但是兔的淚腺非常發(fā)達(dá)，杯狀細(xì)胞密度高，加之有第三眼瞼(相當(dāng)于一個(gè)軟性接觸鏡)的存在，增加了兔干眼模型制作的難度。所以本研究采用苯扎氯銨滴眼液誘導(dǎo)大鼠干眼模型來觀察干眼發(fā)生后眼表組織出現(xiàn)的組織病理學(xué)改變尤其是超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖2 眼表裂隙燈顯微鏡Note.In normal eyes，the cornea is smooth and transparent，and no abnormal fluorescein staining was detected.In the model eyes，the cornea had oedema and hyperemia，and a diffuse fluorescein staining was observed.Fig.2 Slip-lamp photographs of the ocular surface

圖3 角膜結(jié)膜組織病理學(xué)檢查(×200)In the normal rat，there were three to five layers of corneal epithelial cells and stroma with regular collagen fibrils.The conjunctiva is composed of one cuboidal basal layer and three to four layers of epithelial cells with numerous interspersed goblet cells.In the dry eye rat，the corneal epithelium became thinner than normal，and the conjunctival epithelium became thinner.There was obvious loss of goblet cells in the cuboidal basal layer of cornea.Fig.3 Histological examination of the rat cornea and conjunctiva.(×200)

圖4 結(jié)膜杯狀細(xì)胞數(shù)量Note.There are some goblet cells diffused among the conjunctival epithelial cells.Once dry eye occurred，the number of goblet cells is decreased.Fig.4 Number of goblet cells diffusely distributed in the conjunctiva

眼表面覆蓋一層淚膜，正常穩(wěn)定的淚膜是維持眼表上皮正常結(jié)構(gòu)功能的基礎(chǔ)，而眼表上皮細(xì)胞(包括杯狀細(xì)胞及非杯狀細(xì)胞)分泌的黏蛋白又是淚膜的主體結(jié)構(gòu)［17］，眼表上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)是淚膜附著的基礎(chǔ)，完整的眼表上皮結(jié)構(gòu)有利于淚膜穩(wěn)定性和張力的維持［18］。因此眼表上皮細(xì)胞和淚膜之間相互影響相互依賴，任何一方異常均可導(dǎo)致眼表功能異常。角、結(jié)膜上皮細(xì)胞的微絨毛結(jié)構(gòu)是淚膜得以涂布于眼表的必需亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。正常角膜上皮表層細(xì)胞的微絨毛和微皺襞結(jié)構(gòu)有利于角膜上皮對(duì)淚膜中各種成分的黏附［19］，特別是角膜上皮細(xì)胞所分泌的膜結(jié)合型黏蛋白，如MUC1，MUC4和MUC16等［20］。這些黏蛋白均為疏水性黏蛋白，正常情況下，可錨定結(jié)合在角膜結(jié)膜上皮微絨毛上，作為極化跨膜大分子物質(zhì)，疏水端跨膜固定于微絨毛上，而親水端則游離在淚膜中，以此方式將疏水性的角膜結(jié)膜上皮細(xì)胞與親水性的淚膜水樣層聯(lián)系起來［18］。膜結(jié)合型黏蛋白形成的多糖蛋白質(zhì)復(fù)合物是防御致病微生物的屏障，它的濕潤(rùn)性使覆蓋的淚膜保持穩(wěn)定;在眼表上皮變性或脫屑引起表面不潤(rùn)滑時(shí)，淚液中的跨膜黏蛋白可以嵌入眼表面的間隙，從而保持了淚膜的穩(wěn)定性［21］。角膜上皮細(xì)胞微絨毛與其上面的膜結(jié)合型黏蛋白分子共同作用才可以將淚膜通過瞬目均勻地涂布在角膜表面，保護(hù)上皮細(xì)胞免受瞬目摩擦帶來的損傷，維持角膜上皮細(xì)胞的非角化特性［22］。

圖5 角膜結(jié)膜上皮細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)Note.In the normal group，there were many microvilli on the corneal or conjunctival epithelial cells(→)，which had cell-cell junctions(→).The microvilli were sharply reduced in the cornea or conjunctiva(→)of the BAC-treated model group，and beaken(↑)or loosened(→)cell-cell junctions in the rat model group of dry eye.Fig.5 Ultrastructural changes of the corneal or conjunctival epithelium in the rat eyes

圖6 結(jié)膜杯狀細(xì)胞顯微結(jié)構(gòu)Note.There are numerous goblet cells in the conjunctival epithelium containing secretory granules in the normal conjunctiva.The number of goblet cells is decreased in the dry eye rats.Fig.6 Ultrastructure of the conjunctival goblet cells

作為眼表的特殊屏障，淚膜完整性的破壞會(huì)損傷眼表上皮，使淚膜附著功能受損，加重眼表上皮損傷。上皮細(xì)胞的微絨毛結(jié)構(gòu)異常時(shí)，黏蛋白將不能涂布在眼表，不能緊緊鉚釘于上皮細(xì)胞表面。當(dāng)眼表上皮細(xì)胞及杯狀細(xì)胞受損時(shí)，淚膜中的黏蛋白將會(huì)出現(xiàn)質(zhì)或量的異常。黏蛋白質(zhì)或量的異常導(dǎo)致淚膜異常［23］，進(jìn)而發(fā)生干眼，淚膜破裂時(shí)間縮短，導(dǎo)致炎癥發(fā)生，進(jìn)一步造成眼表上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的受損，進(jìn)而淚膜異常加劇。淚膜穩(wěn)定性下降，眼表?yè)p傷加劇，形成惡性循環(huán)。干眼可能存在角膜上皮超微結(jié)構(gòu)如微絨毛異常、淚膜的黏蛋白層損傷或缺失，并最終導(dǎo)致干眼。本研究結(jié)果顯示，透射電鏡中角、結(jié)膜上皮細(xì)胞微絨毛明顯減少，部分細(xì)胞表面微絨毛缺失，殘存微絨毛也呈短、細(xì)狀;這一現(xiàn)象與淚膜功能密切相關(guān)。我們推測(cè)本研究中苯扎氯銨導(dǎo)致角膜上皮超微結(jié)構(gòu)的改變，很可能是引起干眼相關(guān)改變的機(jī)制之一。

綜上所述，苯扎氯銨誘導(dǎo)的大鼠干眼模型可導(dǎo)致淚液分泌量的減少、淚膜穩(wěn)定性下降以及角膜結(jié)膜上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，影響眼表穩(wěn)態(tài)，從而誘發(fā)干眼。然而，苯扎氯銨對(duì)眼表穩(wěn)態(tài)的影響涉及多種機(jī)制，除了已證實(shí)其對(duì)角結(jié)膜細(xì)胞生長(zhǎng)活性劑分泌功能的影響外，可能也與其引起角結(jié)膜上皮亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變?nèi)缥⒔q毛等結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致淚膜中蛋白層損傷或缺失有關(guān)。

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Morphological changes of corneal and conjunctival epithelia in a rat model of dry eye

ZHANG Hui-qin1，2，LI Ying1，XU Yong-gen1
(1.Department of Ophthalmology，Peking University Third Hospital，Beijing 100191，China; 2.The First of the Department of Ophthalmology，Cangzhou Central Hospital，Cangzhou 061000)

ObjectiveTo evaluate the rat model of dry eye induced by topical administration of benzalkonium chloride and compare the morphological characteristics of corneal and conjunctival tissues of the normal and model rats.MethodsTopical administration of benzalkonium chloride(0.3%)twice per day for seven days to induce the rat model of dry eye.Pathology with HE and periodic acid-Schiff staining and transmission electron microscopy were performed to evaluate the corneal and conjunctival changes.ResultsThe corneal and conjunctival epithelial cells were sloughed off，the number of goblet cells was decreased in the dry eye model.Microvilli were obviously lost in the surface epithelial cells of the dry eye rat cornea and conjunctiva compared with the normal rats，as indicated by the amount and size of microvilli.ConclusionsThe changes in the corneal and conjunctival epithelia of BAC-induced rat dry eye are similar to the changes in human dry eye.This rat model may play an essential role for dry eye studies in the future.

Dry eye; Benzalkonium chloride; Epithelialcells; Cornea; Conjunctive; Pathology; Ultrastructure;Rat

R-33

A

1671-7856(2016)12-0045-06

10.3969.j.issn.1671-7856.2016.12.009

2016-07-19

張慧芹(1988-)，女，碩士生，研究方向:眼表?yè)p傷、修復(fù)。E-mail:zhanghuiqinzjk@163.com。

許永根(1966-)，男，研究方向:角膜病，白內(nèi)障眼表?yè)p傷、修復(fù)。Email:edman1029@aliyun.com。