段哲萍 于新江 李 芳 李菁菁 趙 娟

(河北省人民醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050051)

鼠婦提取物對血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響

段哲萍 于新江1李 芳2李菁菁3趙 娟3

(河北省人民醫(yī)院腫瘤二科，河北 石家莊 050051)

目的探討鼠婦水提取物及乙酸乙酯提取物對骨橋蛋白(OPN)誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞(VSMC)增殖及遷移的影響。方法采用細胞培養(yǎng)、流式細胞術(shù)、MTT等方法，觀測鼠婦不同濃度的水及乙酸乙酯提取物分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)情況下及OPN誘導(dǎo)的條件下針對VSMC凋亡、增殖、遷移的影響作用。結(jié)果①OPN組及各濃度鼠婦水提取物、鼠婦乙酸乙酯提取物對于晚期平滑肌細胞的凋亡無影響。②不加入OPN刺激時，鼠婦水提取物對于細胞增殖起促進作用，且隨著鼠婦水提取物濃度的增加，促進作用增強，呈劑量依賴性。鼠婦乙酸乙酯提取物抑制細胞增殖，鼠婦乙酸乙酯提取物各濃度的增加，抑制作用加強，呈劑量依賴性。給予OPN作用細胞后，兩種提取物均發(fā)揮抑制細胞增殖作用。③OPN組、OPN+低濃度(0.5 mg/ml)鼠婦水提取物組、OPN+高濃度(1.00 mg/ml)鼠婦乙酸乙酯提取物組均可使細胞遷移數(shù)量增多，均有促細胞遷移的作用，其中OPN組遷移的細胞數(shù)量最多，OPN+低濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組、OPN+高濃度鼠婦水提取物組次之。結(jié)論鼠婦提取物作為一種純生物制劑，對于正常生長和刺激增殖后的平滑肌細胞作用是不同的；其對動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展變化的抑制作用不是通過促進細胞凋亡來實現(xiàn)的。

鼠婦提取物；血管平滑肌細胞；細胞增殖；細胞遷移

血管平滑肌細胞(VSMC)增殖及其向血管內(nèi)膜下遷移是動脈粥樣硬化性心臟病、高血壓、血管成形術(shù)后再狹窄等血管重塑相關(guān)性疾病的重要病理學(xué)基礎(chǔ)。研究表明〔1〕，多種細胞外基質(zhì)(ECM)成分和生長因子都對VSMC的黏附、遷移及增殖過程起到參與和調(diào)節(jié)作用，例如骨橋蛋白(OPN)、纖連蛋白(FN)等等。血管炎性增生致使血管管腔狹窄，這種血管的重塑性是引起缺血性心臟病的重要病因之一。鼠婦屬節(jié)肢動物門甲殼綱潮蟲亞目潮蟲科，可通過抑制環(huán)氧化物酶(COX)而發(fā)揮抗炎功效〔2～5〕。但鼠婦對于血管炎性增生條件下VSMC增殖和遷移的影響尚未見相關(guān)文獻。本研究探討鼠婦提取物對OPN刺激誘導(dǎo)的VSMC的凋亡情況、遷移增殖的作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠1只，體質(zhì)量90～100 g，動物許可證號SCXK(冀)-1-003，河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。主要試劑：改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS，Gibco公司)，噻唑藍(MTT)和OPN(Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sandland公司)。鼠婦兩種提取物(河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院制備、鑒定、濃度測定，李愛英教授贈送)。主要儀器：普通光學(xué)顯微鏡CXZLFS1(Olympus公司)，倒置顯微鏡XDS-1B(Olympus公司)，MCO175 CO2恒溫培養(yǎng)箱(SANYO公司)，酶標儀ELX800型(Bio-Tek公司)，形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)801系列(江蘇捷達科技發(fā)展有限公司)，流式細胞儀FACSTAR Calibur型(BD公司)。

1.2細胞培養(yǎng) 使用貼塊法，常規(guī)分離及培養(yǎng)大鼠主動脈VSMC。首先向SD大鼠腹腔內(nèi)注射25%烏來糖1～2 ml進行全身麻醉，成功麻醉后自主動脈弓至腹主動脈分叉處之間將血管離斷，取下后放入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，去除血管周圍多余的脂肪并沖洗管腔內(nèi)殘留的多余血液，清洗干凈后，血管轉(zhuǎn)移浸泡至新的10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，縱向剪開血管壁，后血管壁剪碎成若干1.0 mm×1.0 mm的小片；剪好的血管小片分成3份，分別貼于干凈的小培養(yǎng)瓶壁上，倒置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，瓶中加入含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液，孵育2～3 h，使貼塊穩(wěn)固貼于培養(yǎng)瓶壁上；反轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，充分浸潤貼壁的血管小片，定期顯微鏡下觀察細胞長勢；2～3 d更換一次培養(yǎng)液，5～7 d后將原代細胞消化后進行傳代。

1.3細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)。取培養(yǎng)3～5代的對數(shù)生長期SD大鼠主動脈平滑肌細胞，隨機分為8組，每組5瓶。對照組僅加入細胞，OPN組加入20 μg/ml OPN，OPN+鼠婦水提取物0.5、1.0、2.0 mg/ml組分別加入20 μg/ml OPN及0.5、1.0、2.0 mg/ml鼠婦水提取物，OPN+鼠婦乙酸乙酯提取物0.25、0.50、1.00 mg/ml組分別加入20 μg/ml OPN及0.25、0.50、1.00 mg/ml鼠婦乙酸乙酯提取物。各組均置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育24 h，分別收集各組細胞，PBS清洗細胞2～3次，常溫離心機下離心6 min(2 000 r/min)，棄上清，70%乙醇固定好細胞，置振蕩器混勻，4℃冰箱密封保存。7 d內(nèi)于河北醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院實驗中心進行流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率。

1.4細胞增殖情況檢測 采用MTT法。取3～5代的對數(shù)生長期SD大鼠主動脈平滑肌細胞，稀釋后調(diào)整細胞密度為5×104個/ml，96孔板接種，將細胞隨機分為8組，分組及處理方法同1.3?？瞻捉M即調(diào)零孔設(shè)置(培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，對照孔設(shè)置(細胞、培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，OPN組(細胞、OPN、培養(yǎng)基、MTT、DMSO)，實驗孔(細胞、OPN、不同濃度鼠婦水提取物及鼠婦乙酸乙酯提取物、培養(yǎng)液、MTT、DMSO)。各組均置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育24 h，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)孵育4 h，去除上清，終止細胞培養(yǎng)；接種的每孔分別加入150 μl DMSO，為充分溶解結(jié)晶物將96孔板放置于搖床上低速振蕩15 min，酶聯(lián)免疫檢測儀測定并記錄490 nm波長處各孔吸光度值(A值)。

1.5細胞遷移情況檢測 采用劃痕實驗。收集培養(yǎng)3～5代的對數(shù)生長期SD大鼠主動脈平滑肌細胞，調(diào)整細胞密度為5×104個/ml，接種于6孔板(內(nèi)置預(yù)先包被的載玻片)。待細胞生長至100%匯合時，于6孔板中取出載玻片，用無菌吸頭在載玻片上進行劃痕。PBS洗凈掉劃痕中被刮下的細胞，將玻片重新置于培養(yǎng)液中培養(yǎng)，隨機分為對照組、OPN組、OPN+低濃度0.5 mg/ml鼠婦水提取物組、OPN+高濃度1.00 mg/ml鼠婦乙酸乙酯提取物組，每組2孔。各組均置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)溫育24 h，低倍顯微鏡下觀察細胞遷移數(shù)量，計數(shù)各組遷移細胞的數(shù)量，以此代表細胞的遷移活性程度。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1晚期細胞凋亡 OPN組及OPN+各濃度鼠婦水提取物組、OPN+各濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組細胞凋亡無統(tǒng)計學(xué)差異(Pgt;0.05)。凋亡率分別為OPN組(1.580 0±0.100 00)、OPN+鼠婦水提取物0.5 mg/ml組(1.633 3±0.251 66)、OPN+鼠婦水提取物1.0 mg/ml組(1.653 3±0.283 08)、OPN+鼠婦水提取物2.0 mg/ml組(1.456 7±0.060 28)；OPN+乙酸乙酯提取物0.25 mg/ml組(1.413 3±0.032 15)、OPN+乙酸乙酯提取物0.50 mg/ml組(1.546 7±0.098 66)、OPN+乙酸乙酯提取物1.00 mg/ml組(1.786 7±0.568 98)。

2.2細胞增殖 在不加入OPN刺激時，鼠婦水提取物對于細胞增殖起促進作用，且隨著鼠婦水提取物濃度(0.5、1.0、2.0 mg/ml)的增加，促進增殖作用增強(0.605 67±0.021 127、0.813 00±0.036 592、1.168 33±0.187 164)，呈劑量依賴性，空白組(0.369 33±0.003 055)和對照組(0.464 67±0.017 039)無統(tǒng)計學(xué)差異，對照組與鼠婦水提取物0.5 mg/ml組無統(tǒng)計學(xué)差異，而空白組與各濃度鼠婦水提取物組均有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。鼠婦乙酸乙酯提取物對細胞增殖起抑制作用，且隨濃度(0.25、0.50、1.00 mg/ml)的增加，抑制增殖作用逐漸增強(0.740 00±0.025 239、0.568 33±0.131 838、0.392 00±0.030 610)，呈劑量依賴性?？瞻捉M(0.317 33±0.012 055)和對照組(0.686 33±0.008 021)、鼠婦乙酸乙酯提取物組(0.25、0.50 mg/ml)有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)，對照組與鼠婦乙酸乙酯提取物0.50、1.00 mg/ml組有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。給予OPN刺激誘導(dǎo)細胞后，鼠婦兩種提取物均發(fā)揮細胞增殖抑制作用，空白組(0.019 67±0.004 726)、對照組(0.222 00±0.005 292)與OPN組(0.277 67±0.001 155)、OPN+2.0、1.0、0.5 mg/ml鼠婦水提取物組(0.264 67±0.003 055、0.252 33±0.003 215、0.237 33±0.006 658)之間均有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)?？瞻捉M、對照組、OPN組及OPN+各濃度(1.00、0.50、0.25 mg/ml)鼠婦乙酸乙酯提取物組(0.226 67±0.001 528、0.255 33±0.005 033、0.265 33±0.005 033)均有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。OPN+0.50 mg/ml及OPN+1.00 mg/ml鼠婦乙酸乙酯提取物組對細胞增殖抑制最明顯(Plt;0.05)。

2.3細胞遷移 OPN組〔(161.67±3.786)個〕、OPN+0.5 mg/ml鼠婦水提取物組〔(124.00±5.292)個〕、OPN+1.00 mg/ml鼠婦乙酸乙酯提取物組細胞遷移〔(112.33±2.517)個〕增多，對照組〔(99.67±6.506)個〕與OPN組、OPN+1.00 mg/ml鼠婦乙酸乙酯提取物組、OPN+0.50 mg/ml鼠婦水提取物組有統(tǒng)計學(xué)差異(Plt;0.05)。

3 討 論

血管重塑類疾病如高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、血管成形術(shù)后再狹窄的重要細胞病理學(xué)改變與VSMC表型的轉(zhuǎn)化、黏附、遷移、細胞增殖、ECM均密切相關(guān)。病理改變過程中，VSMC黏附、進而沿血管內(nèi)膜下遷移并定位增殖，造成血管炎性增生，引起血管重塑，這一復(fù)雜的病理改變過程受控于細胞與ECM之間相互作用的微細調(diào)整的動態(tài)平衡。同時，多種生長因子和許多ECM內(nèi)成分如OPN、FN等等均參與VSMC黏附、增殖、遷移的調(diào)節(jié)過程中。鼠婦也稱鼠負、負蟠、鼠姑、地虱等，因此蟲喜棲陰暗潮濕的地方，與鼠習(xí)性類似，其背委曲，如有所負，故名鼠負?！侗静菥V目》中有描述鼠婦具有破瘀血、通經(jīng)絡(luò)及平喘、解毒、利尿、止疼等多種藥用功能。動物實驗研究報道：鼠婦可以治療小鼠心律失常，減輕大鼠的疼痛，減輕小鼠炎癥反應(yīng)等等〔6～18〕。目前臨床有報道利用鼠婦制劑治療痔瘡、皮膚疣、晚期惡性腫瘤癌痛、手術(shù)后疼痛、口腔炎、扁桃體炎、慢性支氣管炎、肝癌黃疸及腹水得到良好效果〔6～18〕。目前研究發(fā)現(xiàn)血管炎性反應(yīng)增生，導(dǎo)致管腔狹窄，造成缺血性心臟病。而鼠婦可經(jīng)由抑制環(huán)氧化物酶(COX)起到減輕炎癥的作用，參與血管重塑性疾病的發(fā)生和發(fā)展的整個過程中〔19,20〕。本研究提示無論是鼠婦水提取物還是乙酸乙酯提取物，對于OPN刺激后的平滑肌細胞遷移都是有抑制作用的。

綜上，鼠婦作為一種純生物制劑，對于正常生長和刺激增殖后的平滑肌細胞作用是不同的。生物制劑或一些經(jīng)典的中成藥物往往對于臨床的病理變化具有雙向調(diào)節(jié)作用，而這種作用目前機制不明，可能與藥物濃度不同，或是不同溶劑提取的有效成分不同有關(guān)，需更深入研究證實。鼠婦提取物對于動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程具有一定抑制及減緩作用的，而這種抑制不是通過增加細胞凋亡來實現(xiàn)的。

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〔2016-07-27修回〕

(編輯 苑云杰)

R361

A

1005-9202(2017)22-5541-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.22.023

河北省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥類科研計劃課題(2015138)；河北省教育廳青年基金項目(2011177)

1 河北省人民醫(yī)院心臟外科 2 河北省人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

3 河北醫(yī)科大學(xué)

段哲萍(1975-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事腫瘤研究。