俞進友 仇建玲 朱正峰 周迎 谷文龍

(南通大學附屬建湖醫(yī)院腫瘤中心腫瘤內(nèi)科，江蘇 南通 224700)

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miR-10b、miR145及miR155在乳腺癌患中的表達及臨床意義

俞進友 仇建玲 朱正峰 周迎 谷文龍△

(南通大學附屬建湖醫(yī)院腫瘤中心腫瘤內(nèi)科，江蘇 南通 224700)

目的 探討microRNA-10b(miR-10b)、microRNA-145(miR-145)及microRNA-155(miR-155)在乳腺癌患者病理組織及血清中的表達水平，進而評價其在乳腺癌診斷中的價值。方法 收集100例正常健康志愿者，150例乳腺癌患者血液和39例乳腺癌患者的癌組織和癌旁組織，提取血液和組織中的microRNA，采用實時熒光定量PCR檢測miR-10b、miR-145及miR-155表達水平，分析其與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)之間的相關性,并繪制ROC曲線分析其在乳腺癌診斷中的價值。結果 治療前乳腺癌患者血清中的miR-10b，miR-145和miR-155表達水平高于對照組(P<0.05)，三者表達水平均與腫瘤轉移顯著相關，與年齡、組織學特征、ER表達無相關性(P>0.05)miR-10 b與臨床分期顯著相關(P<0.05)，miR-10b的ROC曲線下面積為0.936，miR-145的ROC曲線下面積為0.904，miR-155的ROC曲線下面積為0.91。miR-10b，miR-145，miR155在Ⅲ級乳腺癌患者腫瘤組織的表達水平明顯高于Ⅰ～Ⅱ級乳腺癌患者癌組織的表達水平(P<0.05)。結論 血清中miR-10 b、miR-145及miR-155有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤標志物。

microRNA； 乳腺癌； 腫瘤分期

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤。我國新診斷乳腺癌患者占世界乳腺癌患者12.2%[1]，嚴重危害婦女健康。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展涉及諸多因素，而基因水平的表達變化則是最為重要的調(diào)控因素[2]，miRNA在微觀水平上調(diào)控著乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼的小RNA ，廣泛存在于動物、植物和病毒中，通過與目標mRNA的3'UTR序列互補配對，調(diào)控靶基因的表達或翻譯，參與生物體的發(fā)育、炎癥、腫瘤等多種生理、病理過程[3]。最近發(fā)現(xiàn)miRNA在乳腺癌中表達譜的研究提示其可能成為一種新的疾病診斷、分類和預后判斷的工具。miR-10b作為miRNA家族中的一員，在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等腫瘤組織中均存在異常表達，并且與腫瘤的侵襲及遠處轉移有密切關系。miR-145在乳腺癌組織中表達異常，且與病理分級、淋巴結轉移、腫瘤大小有關。miR-155是最早被發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的miRNA，不僅在乳腺癌內(nèi)表達增高，而且可以促進體內(nèi)外乳腺癌細胞的增殖和生長[4]。血漿中也存在miR-155，其能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到舛３址€(wěn)定性，這表明血液循環(huán)中的miR-155有可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標志物[5]。然而這三個miRNA在中國人群中研究不多，本研究采用實時熒光定量PCR方法，檢測中國人群血清中miR-10b、miR-145及miR-155的表達水平，分析其與乳腺癌臨床病理特征之間是否存在可靠的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 以2014年6月至2014年12月于我院就診的150例乳腺癌患者作為病例組，抽取外周血樣本，其中39例另有蠟塊切片樣本，所有病例均經(jīng)過病理學診斷證實，并附有詳細的病理資料。取這一時段內(nèi)至醫(yī)院體檢健康人外周血樣本100份作為對照組。病例組中，年齡22～75歲，平均年齡52歲，兩組樣本在性別、年齡等人口學資料上差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。乳腺癌患者均按 WHO乳腺腫瘤分類標準進行病理學分型，在采集血液標本前均未經(jīng)手術，未經(jīng)放、化療，且無炎癥等合并癥。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 總RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司； All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit試劑盒購于廣州復能基因有限公司；Real-Time PCR試劑盒購自Promega公司；miR-10b、miR-145、miR-155引物購自廣州復能基因有限公司(has-miR-10b-5p引物貨號HmiRQP0034，hsa-miR-145-5 p引物貨號HmiRQP0192，hsa-miR-155-5 p引物貨號HmiRQP0221)。人miRNA外參及外參檢測引物購自天根生化科技(北京)有限公司(miRNA外參貨號CR100-01，miRNA外參檢測引物貨號CD100-01)。

1.2.2 提取血液總RNA 每份取200 μL血清，加入等量的人miRNA外參，嚴格按照總RNA提取試劑盒說明書進行，按RNA量加入DEPC水溶解RNA。核酸蛋白定量儀上測定RNA溶液D260/D280吸光值，計算RNA濃度和純度，D260/D280比值介于1.8～2.0方可用于cDNA合成。2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。取少量定量后的RNA稀釋為1 μg/μL用于逆轉錄。其余RNA立即存放于-80 ℃冰箱中。

1.2.3 miRNA的逆轉錄 使用All-in-OneTMmiRNA qPCR Kit試劑盒進行逆轉錄。模板RNA 濃度調(diào)至40 ng/μL管加入2.5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL、RTase Mix 1 μL、5×PAP/RT Buffer 5 μL、RNase/Dnase free water補足至25μL體系。PCR儀中設定以下程序進行反轉錄：Step1：37 ℃，60min；Step2：70 ℃，15min。

1.2.4 miRNA 的實時熒光定量檢測 用實時熒光定量 PCR 方法檢測miR-10b、miR-145、miR-155及外參在血清中的表達情況。熒光定量PCR采用20 μL的反應體系，每孔加入2×Mix 10 μL、特異引物2 μL、通用引物(2 μM) 2 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 4 μL。每管設3個復孔。反應條件為：95 ℃ 預變性10 min，95 ℃變性10 s，Tm-2 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。

1.3 統(tǒng)計學方法 microRNA的相對表達量以 2-ΔΔCt法計算，公式: ΔΔCt =[(樣本 CtmicroRNA-樣本 Ct外參)-(對照組 CtmicroRNA-對照組Ct外參)]。組間比較采用t檢測，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用受試者工作曲線(ROC曲線)及曲線下面積(AUC)評價miR-10b、miR-145及miR-155作為一種診斷方法的臨床應用價值。

2 結 果

2.1 miR-10b、miR-145及miR-155在乳腺癌患者與健康人血清中表達差異 熒光定量PCR檢測乳腺癌患者與健康對照組血清中的miRNA的表達水平，三種miRNA在乳腺癌患者血清中表達水平均上升，miR-10 b在病例組患者血清中的表達水平為[(6.824±0.194)，對照組標準化為1]，miR-145在病例組患者血清中的表達水平為[(10.110±0.305),對照組標準化為1]，miR-155在病例組患者血清中的表達水平為[(13.233±0.641)，對照組標準化為1]，與對照組相比，P均<0.01,差異有統(tǒng)計學意義。

2.2 ROC曲線分析血清miR-10b、miR-145及miR-155對乳腺癌患者的診斷價值 以靈敏度為縱坐標，誤診率(100-特異度)為橫坐標在SPSS軟件上繪制ROC曲線圖，然后計算曲線下面積(AUC)。miR-10 b ROC曲線中AUC=0.936; miR-145 ROC曲線中AUC=0. 904，miR-155 ROC曲線中AUC=0.91，miR-10b、miR-145及miR-155對乳腺癌的診斷均有很好的準確性。

2.3 miR-10b、miR-145及miR-155的表達水平與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關系 乳腺癌患者血清中miR-10 b相對表達量與臨床TNM分期有顯著相關性(P<0.05)， M期患者血清中miR-10b相對表達量高于T、N期;而乳腺癌患者血清中miR-145與miR-155相對表達量與臨床TNM分期無顯著相關性(P>0.05);有淋巴結轉移患者血清中miR-10b、miR-145和miR-155的相對表達水平高于無淋巴結轉移患者(P<0. 05) ; 乳腺癌患者血清中miR-10b、miR-145和miR-155相對表達量與年齡、組織學特征、雌激素受體狀態(tài)無明顯相關性(P>0.05)，見表1。

表1 血清 miR-10b、 miR-145、miR-155表達水平與乳腺癌患者臨床病例參數(shù)的關系

2.3 miR-10b、miR-145及miR-155在不同病理分級乳腺癌組織中的表達 熒光定量PCR檢測乳腺癌病理組織中miR-10b、miR-145、miR-155的相對表達量，Ⅲ級乳腺癌病理組織中miR-10b、miR-145、miR-155相對表達量高于Ⅰ～Ⅱ級患者，呈正相關，其中miR-155與病理分級相關性最好，病理分級越高，表達量越高。

3 討 論

miRNA是一類長約22～25 bp的核糖核酸分子，miRNA能夠識別靶基因的3’UTR區(qū)，負向調(diào)控靶基因mRNA的降解，進而調(diào)節(jié)靶基因的功能。血液中循環(huán)miRNA具有很好的穩(wěn)定性，可作為腫瘤診斷的生物標志物。

miRNA在多種惡性腫瘤中都有差異性表達，而且表達水平與組織病理學特征以及疾病的不同階段之間存在著密切關系。血液循環(huán)中的miRNA是由腫瘤細胞選擇性分泌的，腫瘤細胞與正常組織細胞之間miRNA的表達譜存在巨大差異。miRNA在腫瘤發(fā)生過程中起到類似于癌基因或抑癌基因的作用，腫瘤細胞中miRNA表達水平上調(diào)，則視為癌基因，反之則視為抑癌基因。本實驗選取的三個miRNA在血清中表達水平均上調(diào)，而腫瘤組織中miR-155與腫瘤的病理分級呈正相關，在腫瘤的發(fā)展過程中有正向調(diào)節(jié)作用。因為miRNA 在組織及血液中相對表達量甚微，實驗選取的三指標上調(diào)，相對于負向調(diào)節(jié)作用的miRNA，更容易被檢測到，為miR-10b、miR-145和miR-155成為乳腺癌腫瘤標記物提供了幫助。同時，本實驗采用添加miRNA外參檢測的方法，排除了常見內(nèi)參(U6)的差異帶來的影響，增加了檢測結果的準確性[6]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，miR-10b、miR-145和miR-155在乳腺癌患者血清中表達均明顯上調(diào)，三種miRNA表達水平均與腫瘤轉移顯著相關，但與年齡、組織學特征、ER表達無相關性，表明三種miRNA參與到腫瘤的轉移過程中，但需要增加檢測臨床樣本量，同時詳盡的分子機制有待后續(xù)研究[7]。本研究還發(fā)現(xiàn)miR-10b與臨床分期顯著相關，M期乳腺癌患者血清中miR-10b的相對表達量明顯高于T、N期患者，但miR-145和miR-155卻與臨床分期無相關性。miR-145的ROC曲線下面積為0.936，miR-155的ROC曲線下面積為0.904，miR-10b的ROC曲線下面積為0.91，均高于0.9，表明三種miRNA具有很高的診斷價值。同時我們檢測發(fā)現(xiàn)，miR-10b，miR-145和miR-155在病理Ⅲ級乳腺癌患者腫瘤組織的表達水平明顯高于Ⅰ-Ⅱ級乳腺癌患者癌組織的表達水平(P<0.05)，miR-155在乳腺癌患者腫瘤組織的表達水平與分期相關，病理分級越高，miR-155相對表達水平越高。miR-10 b、miR-145和miR-155的在乳腺癌患者血清中表達水平與乳腺癌的臨床病理標本并不一致。綜上所述，miR-10b、miR-145和miR-155可能成為新一代的乳腺癌腫瘤標志物。

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Clinical significance and expression level of microRNA-10b and microRNA-145 and microRNA-155 in the patients with breast cancer

YuJinyou,QiuJianling,ZhuZhengfeng,ZhouYing,GuWenlong.

DepartmentofInternalMedicine,AffiliatedofJianhuHospitalTumorCenter,NantongUniversityinJiangsu.Nantong224700,Jiangshu,China.

Objective To investigate the expression level of microRNA-10b(miR-10b), microRNA-145(miR-145)and microRNA-155(miR-155)in the pathological tissue and serum of patients with breast cancer, and to evaluate its value in the diagnosis of breast cancer. Methods Peripheral blood was collected from 100 healthy volunteers and 150 patients with breast cancer, and cancer tissue and adjacent tissue in 39 patients with breast cancer were collected. The expression levels of miR-145 and miR-10b were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. Then the correlation between the trend of miR-10b，miR-145 and miR-155 in serum and in tumor tissue was analyzed. Results The expression level of miR-10b, miR-145 and miR-10b in serum of patients with breast cancer was significantly higher than that in control group (P<0.05). The expression of three microRNAs were associated with tumor metastasis and not correlated with age, histological features and the expression of ER. The expression of miR-10b was significantly correlated with the clinical staging (P< 0.05), the area under ROC curve of miR-10b, miR-145 and miR-155 was respectively 0.936, 0.904 and 0.91. The expression of miR-10b, miR-145 and miR-155 in the breast cancer tumor tissue with stage Ⅲ was significantly higher than that of breast cancer tissue with Ⅰ～Ⅱ stage. Conclusion miR-10b, miR-145 and miR-155 may be used as tumor markers in early diagnosis of breast cancer.

microRNA； Breast cancer； Tumor stage

江蘇省衛(wèi)計委2014年重大課題招標項目 (項目編號YG201418)

R737.9

A

1000-744X(2016)07-0683-03

2016-04-07)

△通信作者