徐淑菲，孔繁德，苗 麗，蔡振鴻，林振基，趙 冉

（1. 廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門(mén) 361026；2. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南鄭州 450003；3. 廈門(mén)市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門(mén) 361010；4. 廈門(mén)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心，福建廈門(mén) 361000）

LAMP技術(shù)研究進(jìn)展及其在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

徐淑菲1，孔繁德1，苗 麗2，蔡振鴻3，林振基1，趙 冉4

（1. 廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門(mén) 361026；2. 河南出入境檢驗(yàn)檢疫局，河南鄭州 450003；3. 廈門(mén)市思明區(qū)市政管理中心，福建廈門(mén) 361010；4. 廈門(mén)市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)測(cè)試中心，福建廈門(mén) 361000）

本文從技術(shù)原理、研究進(jìn)展及在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用三個(gè)方面對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)進(jìn)行了闡述。與普通PCR、熒光定量PCR相比，LAMP技術(shù)具有不需要精密儀器、肉眼即可判定、操作簡(jiǎn)單、所用時(shí)間短、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在水生和陸生動(dòng)物的細(xì)菌病、病毒病、寄生蟲(chóng)病的檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。LAMP技術(shù)與其他技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用以及LAMP檢測(cè)儀器的出現(xiàn)，更加促進(jìn)了LAMP技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；檢測(cè)；發(fā)展；應(yīng)用

目前的動(dòng)物疫病檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)和生化方法、分離鑒定方法、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、蛋白質(zhì)指紋圖譜分析方法等。隨著基因組測(cè)序工作的完成，分子生物學(xué)方法作為一種快速檢測(cè)病原菌的手段得到廣泛應(yīng)用，如核酸探針技術(shù)、PCR技術(shù)、熒光定量PCR方法、生物芯片技術(shù)、LAMP技術(shù)等。核酸雜交、PCR等方法應(yīng)用廣泛，但在實(shí)際運(yùn)用中，還存在一些難以克服的問(wèn)題，如假陽(yáng)性、引物二聚體非特異性擴(kuò)增，以及片狀拖帶、涂抹帶，等等。

LAMP技術(shù)即環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplifcation，LAMP），因其不需要PCR儀和昂貴的試劑，目前已被廣泛應(yīng)用于腫瘤篩選、植物病毒檢測(cè)、轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)、動(dòng)物胚胎性別鑒定、水生和陸生動(dòng)物的細(xì)菌性及病毒性疫病檢測(cè)等[1]。

與普通PCR、熒光定量PCR技術(shù)相比，LAMP的優(yōu)點(diǎn)突出：（1）不需要昂貴的精密儀器，恒溫狀態(tài)即可；（2）擴(kuò)增效率高，能夠獲得大量擴(kuò)增產(chǎn)物；（3）具有高特異性；（4）通過(guò)添加Loop引物，可以加快反應(yīng)，縮短一半的時(shí)間；（5）因擴(kuò)增產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物焦磷酸鎂白色沉淀，肉眼即可觀察結(jié)果，也可借助于斑點(diǎn)雜交或橫向流動(dòng)試紙條等方法輔助結(jié)果檢測(cè)。

1 LAMP原理

LAMP是2000年由日本研究人員Notomi等發(fā)明的一種新型的體外等溫?cái)U(kuò)增特異核酸片段的技術(shù)。其特點(diǎn)是針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，60～65 ℃恒溫?cái)U(kuò)增，15～60分鐘左右即可實(shí)現(xiàn)109～1010倍的核酸擴(kuò)增，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、產(chǎn)物易檢測(cè)等特點(diǎn)。在DNA合成時(shí)，從脫氧核糖核酸三磷酸底物（dNTPs）中析出的焦磷酸離子與反應(yīng)溶液中的鎂離子反應(yīng)，產(chǎn)生大量焦磷酸鎂沉淀，呈現(xiàn)白色，因此可以把渾濁度作為反應(yīng)的指標(biāo)，只用肉眼觀察白色渾濁沉淀，就能鑒定擴(kuò)增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。

1.1 LAMP引物的設(shè)計(jì)

基于靶基因3'端的F3c、F2c和Flc區(qū)，以及5′端的Bl、B2和B3區(qū)等6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物。

FIP（Forward Inner Primer）：上游內(nèi)部引物，由F2區(qū)和F1c區(qū)域組成，F(xiàn)2區(qū)與靶基因3′端的F2c區(qū)域互補(bǔ)，F(xiàn)1c區(qū)與靶基因5′端的Flc區(qū)域序列相同。

F3引物：上游外部引物（Forward Outer Primer），由F3區(qū)組成，并與靶基因的F3c區(qū)域互補(bǔ)。

BIP引物：下游內(nèi)部引物（Backward Inner Primer），由B1c和B2區(qū)域組成，B2區(qū)與靶基因3’端的B2c區(qū)域互補(bǔ)，B1c域與靶基因5’端的Blc區(qū)域序列相同。

B3引物：下游外部引物（Backward Outer Primer），由B3區(qū)域組成，和靶基因的B3c區(qū)域互補(bǔ)。

1.2 擴(kuò)增原理

60～65 ℃是雙鏈DNA復(fù)性及延伸的中間溫度，DNA在65 ℃左右處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。因此，DNA在此溫度下合成是可能的。利用4種特異引物，依靠一種高活性鏈置換DNA聚合酶，使得鏈置換DNA合成在不停地自我循環(huán)。擴(kuò)增分兩個(gè)階段，即第1階段為啞鈴狀模板構(gòu)造的形成過(guò)程，第2階段為擴(kuò)增循環(huán)延伸階段。

1.3 環(huán)引物的應(yīng)用

環(huán)引物雖不影響反應(yīng)的特異性，但增強(qiáng)了反應(yīng)敏感性，并起到加速反應(yīng)的作用。Loop引物結(jié)合到反應(yīng)中間產(chǎn)物環(huán)狀物F1、F2（或者B1c、B2c）之間的區(qū)域上，通過(guò)某種機(jī)制，可使反應(yīng)時(shí)間至少縮短一半[2]。

2 LAMP技術(shù)的發(fā)展

2.1 LAMP檢測(cè)儀器的發(fā)展

隨著LAMP技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)技術(shù)公司逐步研發(fā)出相關(guān)儀器設(shè)備，取代人工肉眼觀察或者電泳檢測(cè)產(chǎn)物，克服肉眼觀察或者電泳帶來(lái)的誤差和污染，使結(jié)果判定更準(zhǔn)確。

LAMP實(shí)時(shí)濁度儀是日本榮研研發(fā)的設(shè)備。此裝置可以完成從基因擴(kuò)增到檢驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程。LAMP實(shí)時(shí)濁度儀在等溫條件（60～65 ℃）下孵化，通過(guò)測(cè)定擴(kuò)增基因時(shí)出現(xiàn)的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂的混濁度，來(lái)判斷是否存在目標(biāo)基因，其最大可以同時(shí)擴(kuò)增測(cè)定32個(gè)樣本，并可提前設(shè)定Loopamp試劑配套所需的測(cè)定條件，實(shí)時(shí)測(cè)定每個(gè)樣本的濁度，所得結(jié)果可在電腦中通過(guò)圖表顯示。此設(shè)備可大大減少手動(dòng)操作產(chǎn)生的氣溶膠，減少污染，并可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)濁度，提高了準(zhǔn)確率。

等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)是一套開(kāi)放式系統(tǒng)。其以IAT（核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)）為基礎(chǔ)，結(jié)合熒光檢測(cè)技術(shù)，在恒溫條件下，通過(guò)添加雙鏈結(jié)合熒光染料，實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增過(guò)程，快速完成核酸擴(kuò)增；通過(guò)實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線和產(chǎn)物溶解曲線，判定陰陽(yáng)性并分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，無(wú)需開(kāi)蓋或其他擴(kuò)增后處理，可應(yīng)用于環(huán)介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP，LOOPLAMP）、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（RCA）、單引物等溫?cái)U(kuò)增 （SPIA）、交叉引物擴(kuò)增技術(shù)（CPA）等各類型等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，也兼容多種熒光指示劑，如生物熒光、熒光染料、鈣黃綠素和熒光探針等。此系統(tǒng)有配套核酸檢測(cè)試劑盒，反應(yīng)試劑可直接擴(kuò)增DNA和RNA樣本，且RNA樣本無(wú)需進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)除可使用配套試劑外，還可使用其他同原理配比試劑。

2.2 LAMP檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展——熒光LAMP技術(shù)

LAMP是一種快速靈敏的檢測(cè)方法，不需要特定的PCR儀器，其靈敏性可以和PCR相媲美，甚至超越PCR。PCR技術(shù)靠加熱使雙鏈DNA解鏈，LAMP技術(shù)則是依靠酶的活性。LAMP在鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA polymerase）的作用下，引物退火結(jié)合到靶序列上并延伸。LAMP反應(yīng)十分迅速，在Loop引物的加速作用下，最低5 min即可完成反應(yīng)。

一般的LAMP技術(shù)只能進(jìn)行單一的靶基因檢測(cè)，限制了LAMP的應(yīng)用。使用熒光標(biāo)記或嵌合染料的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法，以前采用的都是非特異性淬滅。非特異性淬滅降低了實(shí)時(shí)檢測(cè)方法的靈敏性，也限制了多重檢測(cè)技術(shù)熒光團(tuán)的選擇。

美國(guó)Nathan等[3]研究人員，在LAMP基礎(chǔ)上，優(yōu)化了引物，可進(jìn)行多重LAMP反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行多個(gè)靶基因（多達(dá)4個(gè)）的檢測(cè)。

將FIP（F1c+F2）引物5′標(biāo)記淬滅基團(tuán)或熒光基團(tuán)，另外合成F1c的互補(bǔ)序列Fd；Fd的3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)或熒光基團(tuán)、3′端修飾的Fd退火結(jié)合到5′端修飾的FIP序列上，形成Q-FIP/Fd復(fù)合引物。F1c片段一般為20～25個(gè)堿基，其Tm值大于60 ℃，因此Q-FIP/Fd復(fù)合引物仍能在63～65 ℃穩(wěn)定地退火結(jié)合到靶序列上，在沒(méi)有鏈置換DNA聚合酶的作用下不會(huì)出現(xiàn)熒光信號(hào)。在LAMP反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)BIP引物結(jié)合到含有Q-FIP/Fd復(fù)合引物的單鏈DNA模板上進(jìn)行鏈擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，標(biāo)記熒光基團(tuán)的Fd引物解離，熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光不能被淬滅基團(tuán)吸收，從而使熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與LAMP產(chǎn)物的形成完全同步。

將等摩爾數(shù)的Q-FIP、Fd混合，加熱至98 ℃，然后緩慢冷卻至室溫，就可使Q-FIP、Fd退火結(jié)合形成Q-FIP/Fd復(fù)合引物。然而，Q-FIP/Fd復(fù)合引物完全取代FIP會(huì)抑制LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，等摩爾數(shù)的Q-FIP/Fd復(fù)合引物、FIP引物混合物將大大減弱Q-FIP/Fd復(fù)合引物對(duì)擴(kuò)增的抑制作用。與使用野生型Bst DNA polymerase相比，如果LAMP反應(yīng)使用Bst 2.0 DNA polymerase或Bst 2.0 WarmStart DNA polymerase，那么效果會(huì)更好。

單重?zé)晒釲AMP反應(yīng)可以推廣至多重?zé)晒釲AMP反應(yīng)，總的引物濃度不變。每種多重引物的濃度根據(jù)檢測(cè)模板的數(shù)量調(diào)整，為1/n（n為熒光LAMP反應(yīng)的模板數(shù)）。在多重?zé)晒釲AMP反應(yīng)中，優(yōu)先選擇熒光信號(hào)更強(qiáng)的熒光基團(tuán)。ROX是熒光信號(hào)最強(qiáng)的熒光基團(tuán)，Cy5、Cy5.5、HEX次之，6-FAM信號(hào)較弱，難以和背景熒光信號(hào)區(qū)分開(kāi)。

2.3 LAMP檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展——Stem Primers在LAMP中的應(yīng)用

LAMP 6條引物的設(shè)計(jì)，需要選擇8個(gè)引物位點(diǎn)，每條引物的位點(diǎn)和方向都有限制。為了克服這種局限性，Gandelman等[4]建立了一種替代方法STEM-LAMP，用Stem Primers替代Loop Primers。在反應(yīng)速度和特異性上，STEM-LAMP和LOOP-LAMP類似，但STEM-LAMP更具優(yōu)越性、靈活性，體現(xiàn)在：①引物設(shè)計(jì)區(qū)域更廣，局限性更??；②Stem primers不會(huì)結(jié)合到DNA環(huán)狀區(qū)域，無(wú)方向性；③可進(jìn)行多重反應(yīng)；④沒(méi)有置換引物也可以完成反應(yīng)；⑤不僅可以用于定性檢測(cè)，也可以用于定量檢測(cè)。而LOOP-LAMP 需要6條引物 ：2條環(huán)生成引物（FIP、BIP）、2條鏈置換引物（F3、B3）、2條加速引物（LoopF、LoopB）。引物設(shè)計(jì)時(shí)需選擇靶基因上8段不同的區(qū)域，環(huán)生成引物（FIP、BIP）、鏈置換引物（F3、B3）、加速引物（LoopF、LoopB）位置嚴(yán)苛，只能單向與靶基因結(jié)合；LoopF、LoopB必須分別在F1、F2和B1、B2之間，才能易形成引物二聚體（一般FIP、BIP的長(zhǎng)度大于40 bp，更易形成引物二聚體）。

3 LAMP在疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.1 LAMP在人類疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

由于LAMP技術(shù)的快速特異，其被廣泛應(yīng)用于臨床疾病的檢測(cè)，給患者提供及時(shí)有效的醫(yī)療方案。此技術(shù)已被成功用于放線桿菌、人類皰疹病毒6型、人類皰疹病毒7型、肺炎鏈球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測(cè)和多種分枝桿菌的區(qū)別等。

3.2 LAMP在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

3.2.1 用于細(xì)菌的檢測(cè)。LAMP最 初 被Maruyama[5]應(yīng)用于檢測(cè)大腸桿菌O157：H7的stxA2基因，通過(guò)原位法檢測(cè)stx基因，取得了理想的結(jié)果。Akemi Yano等[6]2007年建立了檢測(cè)產(chǎn)腸毒素大腸桿菌LT1、ST1基因的LAMP方法。該方法特異性強(qiáng)，靈敏度高。LT1的檢測(cè)限量為4 CFU/管，ST1的檢測(cè)限量為40 CFU/管，比傳統(tǒng)的PCR方法敏感性高10倍，是診斷產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的簡(jiǎn)單快速高效的方法。Masashi Okamura等[7]運(yùn)用LAMP技術(shù)建立了沙門(mén)菌菌株O9群的鑒定方法，比普通PCR方法靈敏度高1 000倍。ShaoYanchun等[8]建立了同時(shí)檢測(cè)牛奶中沙門(mén)菌和志賀氏菌的多重LAMP-RFLP方法，擴(kuò)增基因分別為invA和ipaH。該方法可根據(jù)不同梯形DNA條帶和限制性酶切分析，即可鑒別沙門(mén)菌和志賀氏菌。還有用于檢測(cè)產(chǎn)毒素霍亂弧菌、副溶血弧菌、抗青霉素的金黃色葡萄球菌、炭疽桿菌等的報(bào)道。

3.2.2 用于病毒的檢測(cè)。Anne-Lie Blomstrom等[9]報(bào)道了一步法RT-LAMP，檢測(cè)豬水泡病病毒，其在30～60 min內(nèi)，即可通過(guò)電泳或者肉眼觀察結(jié)果。Qu等[10]采用LAMP方法檢測(cè)豬細(xì)小病毒，試驗(yàn)結(jié)果表明LAMP方法既可應(yīng)用于豬細(xì)小病毒的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，也可用于養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)。Dukes等[11]2006年建立了檢測(cè)口蹄疫（FMD）的RTLAMP方法。其與熒光定量PCR相比毫不遜色，適用于野外檢測(cè)及發(fā)展中國(guó)家口蹄疫的監(jiān)控。Chen等[12]建立了檢測(cè)H9亞型禽流感病毒的RTLAMP方法。該方法比PCR方法靈敏度高10倍，且與其他亞型的禽流感病毒、新城疫病毒無(wú)交叉反應(yīng)。在112份臨床樣品檢測(cè)中，RT-LAMP檢測(cè)出了所有陽(yáng)性樣品，而RT-PCR卻有7陽(yáng)性樣品沒(méi)有被檢出。Hang Minh Pham等[13]設(shè)計(jì)了新城疫病毒的融合蛋白基因的LAMP引物，建立了檢測(cè)新城疫病毒的RT-LAMP方法。該方法可以直接對(duì)分離培養(yǎng)物及臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度和特異性與巢式PCR相當(dāng)，并具有快速、費(fèi)用低、簡(jiǎn)單易操作的優(yōu)點(diǎn)。

3.2.3 用于動(dòng)物源性成分的檢測(cè)。歐洲國(guó)家食品法規(guī)定，無(wú)論是生肉，還是加工產(chǎn)業(yè)鏈中其他產(chǎn)品，都必須貼標(biāo)簽，因此需要一個(gè)快速準(zhǔn)確的肉品種鑒定方法。Amir Abdulmawjood等[14]建立了檢測(cè)鴕鳥(niǎo)成分的LAMP方法。該方法的檢測(cè)限量為1 pg DNA。加工肉類中常含有的鹽分、香料、食用油等，雖然會(huì)影響PCR的檢測(cè)，但是不影響LAMP的檢測(cè)。

3.3 LAMP在水生動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用

LAMP是檢測(cè)魚(yú)類及甲殼類病原的新的技術(shù)方法。早期診斷對(duì)于水生動(dòng)物疫病的預(yù)防具有重要的作用，而快速檢測(cè)是預(yù)防水生動(dòng)物疫病的最重要一環(huán)。免疫熒光技術(shù)（FAT）、酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）、分子檢測(cè)技術(shù)（PCR、RFLP、AFLP、RAPD等）已經(jīng)被用來(lái)檢測(cè)各種水生動(dòng)物病原。LAMP方法因其較高的特異性、敏感性，在水生動(dòng)物疫病檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用。

在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，關(guān)于遲緩愛(ài)德華氏菌、鮰愛(ài)德華氏菌、鯰魚(yú)愛(ài)德華氏菌、黃鰣魚(yú)諾卡氏菌、白斑綜合征病毒、傳染性皮下壞死病毒、真鯛虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒等，都有LAMP檢測(cè)方法的報(bào)道，均證實(shí)LAMP是一種簡(jiǎn)單快速靈敏的診斷方法。

Tomoya Kono等[15]將LAMP技術(shù)應(yīng)用于水生動(dòng)物白斑病的檢測(cè)，檢測(cè)限量為1 fg，1 h就可完成病毒檢測(cè)，但靈敏度比巢式PCR低10倍。對(duì)蝦白斑綜合癥病毒（WSSV）和傳染性皮下組織和造血器官壞死病毒（IHHNV）為影響世界養(yǎng)蝦業(yè)的兩大重要病毒。He Lin等[16]于2011年建立了同時(shí)檢測(cè)對(duì)蝦WSSV和IHHNV的多重LAMP方法。根據(jù)WSSV的VP28基因和IHHNV的NS1基因分別設(shè)計(jì)LAMP引物，在FIP的F2、F1c及BIP的B2、B1c的接合處均插入限制性內(nèi)切酶，其敏感性比巢式PCR高100倍，比普通PCR高1 000倍。Teng等[17]2006年將RT-LAMP和斑點(diǎn)雜交（DBH）兩種方法結(jié)合，建立了檢測(cè)桃拉病毒的方法。RT-LAMP反應(yīng)結(jié)束后，采用斑點(diǎn)雜交檢測(cè)靶基因的信號(hào)。該方法簡(jiǎn)單有效，適用于現(xiàn)場(chǎng)診斷。Gunimaladevi等[18]根據(jù)錦鯉皰疹病毒的tk基因，設(shè)計(jì)4條引物，建立了LAMP方法。其敏感度和PCR相同，檢測(cè)時(shí)間LAMP 60～90 min，而PCR需要3～4 h，LAMP優(yōu)越性很明顯。

3.4 LAMP在寄生蟲(chóng)檢測(cè)中的應(yīng)用

以LAMP為基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)的檢測(cè)。Hiroshi Iseki等[19]根據(jù)棒狀體蛋白1基因設(shè)計(jì)了同時(shí)檢測(cè)牛巴貝斯蟲(chóng)和雙芽巴貝斯蟲(chóng)的多重LAMP引物。研究結(jié)果表明多重LAMP方法比PCR方法更靈敏。另外，運(yùn)用LAMP技術(shù)檢測(cè)錐蟲(chóng)、瘧原蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)等動(dòng)物寄生蟲(chóng)的報(bào)道也屢見(jiàn)不鮮。

3.5 GenieII實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)的應(yīng)用

史秀杰等[20]、何俊強(qiáng)等[21]在GenieII實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，建立了檢測(cè)傳染性鮭魚(yú)貧血癥病毒、傳染性造血器官壞死病毒的LAMP方法。安元龍等[22]運(yùn)用GenieII實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，以LAMP法熒光檢測(cè)為基礎(chǔ)，建立了對(duì)病毒性出血性敗血癥病毒進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法。侯東君等[23]選定一套可在牛羊肉中特異并靈敏的檢測(cè)出摻雜肉成分的引物對(duì)，以動(dòng)物細(xì)胞色素b基因組為模板，可在恒溫63 ℃特異性擴(kuò)增出豬等基因片段而無(wú)其他擴(kuò)增片段影響。

LAMP技術(shù)還應(yīng)用于胚胎性別鑒定、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)等各個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域，其在適用性、特異性、敏感性方面均具有優(yōu)勢(shì)。

4 結(jié)論與展望

從最初2003年LAMP方法的應(yīng)用到現(xiàn)在，LAMP方法已被成功用于細(xì)菌、病毒、真菌、寄生蟲(chóng)等病原的分子生物學(xué)檢測(cè)和診斷，以及胚胎性別鑒定、轉(zhuǎn)基因檢測(cè)、各種疫病的檢測(cè)，等等。LAMP技術(shù)本身也在改進(jìn)和提高，并與其他技術(shù)合并應(yīng)用，如橫向流動(dòng)試紙條法（LFD）、限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）[8]、斑點(diǎn)雜交（DBH）[17]等。LAMP技術(shù)多數(shù)只能用于檢測(cè)一個(gè)靶目標(biāo)，但經(jīng)過(guò)研究者們精心的設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，LAMP技術(shù)結(jié)合限制性酶切分析，可進(jìn)行雙重LAMP檢測(cè)[16，19]，這推動(dòng)了LAMP的發(fā)展。

在LAMP檢測(cè)儀器方面，也取得了很大成就，從單純的檢測(cè)產(chǎn)物渾濁度的濁度儀到可以進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，可見(jiàn)研究者們對(duì)LAMP方法的認(rèn)可。在其他輔助條件下（其他方法和儀器），LAMP方法將有更多更廣泛的應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Research Progress of LAMP Technology and Its Application in Animal Diseases Detection

Xu Shufei1，Kong Fande1，Miao Li2，Cai Zhenhong3，Lin Zhenji1，Zhao Ran4
（1. Xiamen Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen，F(xiàn)ujian 361026；2. Henan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhengzhou，Henan 450003；3. Xiamen Siming District Municipal Administration Center，Xiamen，F(xiàn)ujian 361010；4. Xiamen Agriculture Product Quality and Safety Test Centre，Xiamen，F(xiàn)ujian 361000）

In this article，the Loop-mediated isothermal amplification（LAMP）technology was introduced in three aspects：technical principle，research progress and its application in animal diseases detection. Compared with the general PCR and fuorogenic quantitative PCR，the LAMP method has many advantages，including no need of precision instruments，judging results only by naked eyes，easy operation，costing less time and high sensitivity. Based on these advantages，the LAMP has been widely applied to the detection of bacterial，viral and parasitic diseases of aquatic and terrestrial animals. The development and application of LAMP are further facilitated by the combined application between LAMP and other techniques，as well as the emergence of the LAMP detecting instrument.

Loop-mediated isothermal amplifcation（LAMP）；detection；development；application

book=75,ebook=81

S851.3

A

1005-944X（2017）01-0075-06

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.022

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014IK089）；福建省科技計(jì)劃引導(dǎo)項(xiàng)目（2015Y0031）；廈門(mén)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（3502Z20154079）