陳 茹

（廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州 510623）

反芻動物分枝桿菌病及其進出境檢疫技術(shù)應用探討

陳 茹

（廣東出入境檢驗檢疫局技術(shù)中心，廣東廣州 510623）

反芻動物結(jié)核病、副結(jié)核病等分枝桿菌病對全球畜牧業(yè)危害嚴重，是國際貿(mào)易中重點防范的動物疫病。本文從病原學、檢測方法及其應用方面，對反芻動物結(jié)核病、副結(jié)核病進行了綜述，并結(jié)合我國進出境動物檢驗檢疫工作實際，就上述疫病口岸檢疫技術(shù)的運用進行了探討。同時，針對動物種類及相應檢測方法與試劑選用等具體情況，提出了建議。

反芻動物；牛結(jié)核；副結(jié)核；分枝桿菌；進出境檢驗檢疫

反芻動物結(jié)核病、副結(jié)核病等分枝桿菌病給全球畜牧業(yè)帶來了嚴重經(jīng)濟損失，對人類健康亦構(gòu)成了重大威脅。牛結(jié)核病、副結(jié)核病早已被列入世界動物衛(wèi)生組織（OIE）疫病名錄，是國際貿(mào)易中重點關(guān)注的動物疫病。我國對進出境牛、羊等反芻動物，實施嚴格的結(jié)核病、副結(jié)核病檢疫措施。

1 反芻動物結(jié)核病

1.1 病原

分枝桿菌廣泛存在于自然環(huán)境中，迄今已發(fā)現(xiàn)上百種，其中對人畜具有致病性的超過50種[1-2]。分枝桿菌（Mycobacterium）屬放線菌目、分枝桿菌科、分枝桿菌屬，屬內(nèi)劃分為結(jié)核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）、麻風分枝桿菌（Mycobacterium leprae）和非結(jié)核分枝桿菌（Non-tuberculosis mycobacterium，NTM）3大類。MTC可引起人與哺乳動物的結(jié)核病，主要包括結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝桿菌（M.bovis）、卡介苗BCG（Mycobacterium bovisBCG）、非洲分枝桿菌（M.africanum）和田鼠分枝桿菌（M.microti）等菌種。隨著新菌種的發(fā)現(xiàn)與研究的深入，羊分枝桿菌（M.caprae）、鰭分枝桿菌（M.pinnipedil）以及在非洲患者中分離到的M.canettii分枝桿菌也被歸類為MTC成員。有觀點認為羊分枝桿菌也應被列為牛分枝桿菌的亞種[3]。

反芻動物結(jié)核病的病原是MTC的成員，主要致病菌種是牛分枝桿菌。此外，已發(fā)現(xiàn)在一些國家發(fā)生的羊結(jié)核病病原主要為羊分枝桿菌[4]，還有一些動物結(jié)核病由結(jié)核分枝桿菌引起[5-6]。牛分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌能夠在人和多種動物中相互傳播并引起相關(guān)疾病，嚴重影響公共衛(wèi)生安全及人類健康。牛分枝桿菌是MTC中宿主范圍最為廣泛的菌種，可感染人和牛等50多種哺乳動物和20多種禽類[7-8]。在一些發(fā)展中國家，由牛分枝桿菌感染引起的人肺結(jié)核約占10%[8]。國外早期已發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌可感染牛、貓、犬、猴等與人類接觸密切的動物，并從動物結(jié)核病例中已分離到結(jié)核分枝桿菌[5-6]。

1.2 檢測技術(shù)

動物結(jié)核病檢測技術(shù)包括結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應、γ -干擾素體外釋放檢測、病原菌核酸分子生物學檢測、常規(guī)ELISA以及病原菌分離培養(yǎng)等。

1.2.1 結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應。結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應（簡稱皮試）是動物結(jié)核病的傳統(tǒng)檢測方法，應用廣泛，被OIE列為檢測牛結(jié)核的指定方法，可采用牛型結(jié)核菌素（PPD）頸部皮試、牛型PPD尾根部皮試以及采用牛型和禽型PPD頸部比較皮試3種具體操作方法。頸部比較皮試法：在頸部不同部位（同側(cè)需相隔12~15 cm）分別注射牛型PPD和禽型PPD，72 h后，根據(jù)牛型PPD注射部位的皮厚增加減去禽型注射部位的皮厚增加進行結(jié)果判定。禽型PPD皮試結(jié)果代表NTM感染情況，采用2種PPD同時進行皮試，可通過比較排除NTM感染造成的非特異性反應，準確性較高。尾根部皮試的敏感性低于頸部皮試，采用前者時可適當增加注射劑量。迄今對于大多數(shù)非?？苿游锖头锹箍苿游锓N類，尚未能進行皮試檢測適用性驗證評估[9]。結(jié)核菌素的注射劑量和制劑質(zhì)量對于檢測結(jié)果有關(guān)鍵影響。OIE規(guī)定牛型PPD的皮內(nèi)注射劑量不得低于2 000 IU，當用于牛結(jié)核根除計劃時，推薦用5 000 IU。市場上一些結(jié)核菌素制劑在規(guī)定體積內(nèi)達不到2 000 IU[10]。結(jié)核菌素是通過對分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中增殖后的產(chǎn)物，進行蛋白粗提和純化后獲得的診斷制劑，其純度不高，可能含有其他致敏因子，也會導致動物產(chǎn)生過敏反應，出現(xiàn)假陽性[11]。

1.2.2 γ -干擾素體外釋放檢測。γ -干擾素體外釋放檢測的原理是基于血液T淋巴細胞對結(jié)核菌素的細胞免疫反應。需采集肝素抗凝外周血，用牛型PPD和禽型PPD平行刺激血樣，過夜培養(yǎng)后，感染牛分枝桿菌的細胞在PPD的刺激下將分泌產(chǎn)生γ -干擾素（IFN-γ），通過IFN-γ 單克隆抗體夾心ELISA進行檢測。該法也簡稱IFN-γ ELISA。目前代表性的診斷試劑是BOVIGAM牛γ -干擾素檢測試劑盒（OIE批準注冊號20150110）。OIE聲明該產(chǎn)品適用于檢測牛、水牛、山羊和綿羊中牛分枝桿菌以及MTC其他菌種的感染，適用于以下目的：無疫病史確認；發(fā)生疫情后重新確認無疫病狀態(tài)；為動物及其產(chǎn)品的貿(mào)易和移動提供個體無感染或無病原因子證明；對特定動物群體實施根除感染；對疑似病例或臨床病例進行確證診斷（包括對初篩陽性結(jié)果進行確證）；為風險分析提供感染流行狀況評估；為結(jié)核病根除計劃提供輔助檢測[12]。國內(nèi)學者研究表明，與皮試法相比較，用IFN-γ ELISA檢測奶牛結(jié)核病可提高特異性[13]，對于皮試陽性和可疑牛，可用IFN-γ ELISA復檢以排除部分假陽性[14]。

1.2.3 常規(guī)ELISA檢測。常規(guī)ELISA方法在結(jié)核病檢測中目前僅用于檢測抗體，但不及皮試法和IFN-γ ELISA應用普遍，主要影響因素是診斷抗原和檢測靈敏度問題。分枝桿菌感染后早期誘導細胞免疫反應，在晚期才誘導體液免疫反應，所以皮試和IFN-γ ELISA法對早期感染檢測效果好。此外，MTC的菌種生長緩慢，在感染過程的不同階段分泌不同的蛋白質(zhì)，依賴單一抗原蛋白的抗體檢測法靈敏度低，采用多抗原聯(lián)合檢測（雞尾酒法）或多抗原融合蛋白檢測可顯著提高靈敏度[8]?，F(xiàn)代ELISA抗體檢測技術(shù)采用在牛分枝桿菌特有的2種血清優(yōu)勢抗原蛋白（MPB70和MPB83）基礎(chǔ)上增加更多的抗原，檢測靈敏度有了較明顯改進。

1.2.4 核酸分子生物學檢測方法。1998年結(jié)核分枝桿菌全基因組測序以及2003年牛分枝桿菌全基因組測序的完成，為建立結(jié)核病原菌核酸檢測方法提供了分子基礎(chǔ)。目前已報道的有常規(guī)PCR、PCR-核酸探針雜交、實時熒光PCR、固相基因芯片法、液相基因芯片法、變性高效液相色譜法等，檢測的靶基因有MTC特有的插入序列IS6110、IS1081，以及結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌特異的結(jié)構(gòu)蛋白基因。應用較多的是PCR和實時熒光PCR法。美國已發(fā)布結(jié)核病原菌PCR檢測指南標準（ASTME 2048—1999），我國已發(fā)布實時熒光PCR檢測方法國家標準（GB/T 27639—2011）。目前，國內(nèi)外均開展了對皮試陽性牛進行結(jié)核病原菌PCR檢測研究。Barry等[15]從10頭份皮試陽性牛的血樣中檢出9份PCR陽性；蔡宏等[16]從28頭份皮試陽性牛血樣中檢出23份PCR陽性，從12頭份奶樣中檢出7份PCR陽性。

1.3 進出境檢疫技術(shù)探討

進出境動物檢疫時間緊、要求高，需采用適合活體采樣檢測的技術(shù)。隨著國內(nèi)市場對進口動物需求的多樣化，進口品種中除常規(guī)種用或食用的牛羊種類外，還不斷出現(xiàn)鹿、羊駝、長頸鹿等用于觀賞及其他用途的動物種類，給進出境檢疫工作帶來新的挑戰(zhàn)。

對于反芻動物結(jié)核病檢測，皮試法是經(jīng)典方法，也是目前應用最為廣泛的法定檢測方法。但其準確性易受試劑質(zhì)量、具體操作以及NTM感染等多種因素影響。培養(yǎng)法耗時長，并且受到生物安全管理規(guī)定的約束，一般不采用。IFN-γ ELISA法試劑成本較高，采集的血樣需在30 h內(nèi)進行檢測，目前尚未驗證該法是否適用于牛羊之外不常見的反芻動物種類。常規(guī)ELISA方法尚缺乏成熟的市場化試劑。核酸檢測方法需對樣品進行病原菌核酸提取，檢測過程需注意防核酸污染造成的假陽性。在進出境檢疫工作實際中，應在法定檢測方法基礎(chǔ)上，根據(jù)具體情況聯(lián)合運用多種檢測技術(shù)，以確保檢得出、檢得準。

建議如下：（1）對于能夠?qū)嵤┢ぴ嚨膭游铮捎闷ぴ囘M行初篩（首選頸部比較皮試法），對皮試陽性的動物，采用IFN-γ ELISA法進行復核檢測，可再輔助采用經(jīng)驗證可靠的PCR等核酸檢測方法進一步復核；對于不能開展IFN-γ ELISA法檢測的，直接采用核酸檢測方法進行復核檢測。（2）對于不適合實施皮試的動物，可采血樣，直接用IFN-γ ELISA法或核酸方法檢測。IFN-γ ELISA法由于是基于夾心ELISA原理，其酶標抗體是抗IFN-γ 抗體，應適用于各種動物種類的檢測，但OIE目前僅對牛、羊進行了方法和試劑驗證，僅聲明適用于牛、羊，沒有提及其他動物種類。（3）對于不能確定適用診斷試劑類別的動物種類，直接采用PCR等核酸檢測方法。

2 反芻動物副結(jié)核病

2.1 病原

副結(jié)核?。≒aratuberculosis，Johne′s disease）臨床上以動物持續(xù)性腹瀉、慢性消瘦、腸炎等為特征，是一種以牛、羊等反芻動物為主的消耗性、慢性傳染病，馬、鹿等多種動物也可感染發(fā)病。副結(jié)核病的病原是副結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium avium subsp. Paratubercilosis，MAP）。MAP在分類上歸屬鳥分枝桿菌的一個亞種，其主要感染動物消化道，也可感染乳腺和生殖器官，癥狀明顯和隱性感染的病畜均能向體外排菌，主要隨糞便排出，也可經(jīng)乳汁、精液或胎盤垂直感染。目前副結(jié)核病呈全球性分布，難于根除，受其影響較大的仍然是家養(yǎng)或野生類反芻類動物。MAP與人的一種慢性腸道疾病克羅恩氏病的關(guān)聯(lián)是當前醫(yī)學研究的熱點。雖然對于MAP是否是人類克羅恩氏病的致病因子尚有爭議，但MAP對食品安全的影響已在歐美等發(fā)達國家引起廣泛重視。

2.2 檢測技術(shù)

副結(jié)核病檢測技術(shù)包括以ELISA為代表的血清學檢測技術(shù)，以PCR為代表的病原核酸分子生物學檢測技術(shù)、皮試檢測技術(shù)和病原菌分離培養(yǎng)技術(shù)等。OIE將目前已有的各類檢測方法及其適用目的進行了概括[17]。OIE鼓勵聯(lián)合采用多種方法進行副結(jié)核病原或抗體檢測。

2.2.1 ELISA方法。常規(guī)ELISA是目前全球最為廣泛應用的副結(jié)核血清學檢測技術(shù)，普遍采用吸附ELISA技術(shù)原理。其基本檢測步驟：采用含草分枝桿菌（M. phlei）抗原的緩沖液對待檢血清進行預處理，去除非特異抗體的干擾；將經(jīng)預處理的待檢血清加到包被了MAP特異抗原的檢測板中，樣品中MAP抗體與固相包被抗原結(jié)合形成抗原-抗體復合物，洗滌去除非結(jié)合物，加入過氧化物酶標記的抗反芻動物IgG（也有采用酶標記的抗牛IgG、酶標記的蛋白G、蛋白A等）；加入顯色底物，通過測量吸光度值進行結(jié)果判定。由于環(huán)境中存在多種分枝桿菌，若感染動物易產(chǎn)生非特異性抗體，采用M. phlei抗原能夠吸附待檢樣品中非特異分枝桿菌抗體，從而提高檢測特異性。選用副結(jié)核抗體ELISA商品化試劑盒時，需評估其是否適用于不同反芻動物類別。目前一些品牌的試劑盒都聲明適用于牛、羊或小反芻動物，但對于不常見的物種，如羊駝、鹿等野生動物，如果沒有確切信息，則應對擬選用的試劑盒進行驗證或改進。國外學者對商品化試劑盒進行改進，采用酶標記的抗羊駝IgG取代酶標抗牛IgG，使之適用于羊駝副結(jié)核抗體檢測[18]，或采用酶標蛋白A、酶標抗駱駝IgG，來取代抗反芻動物IgG或抗牛IgG，使之適用于駱駝副結(jié)核抗體檢測[19]。

2.2.2 皮試法。副結(jié)核皮試法通過在動物頸部注射禽型PPD或Johnin PPD，來檢測感染后動物體內(nèi)的細胞介導免疫反應。禽型PPD和Johnin PPD分別來自鳥分枝桿菌和MAP培養(yǎng)物的純化蛋白提取物。皮試法由于操作簡單、成本低的特點，在國內(nèi)外仍被廣泛應用。副結(jié)核皮試的常規(guī)判定依據(jù)是注射前后注射部位的皮厚腫脹差。但鹿的副結(jié)核皮試炎癥反應通常呈現(xiàn)為彌散樣斑塊、而腫脹不明顯，因此對于鹿的副結(jié)核皮試檢測，凡注射部位呈現(xiàn)腫脹（無論是否達到通常適用于牛的腫脹差判定標準），應判為陽性反應[17]。

2.2.3 核酸分子生物學檢測方法。副結(jié)核分枝桿菌（MAP）核酸分子生物學檢測鑒定方法是基于核酸擴增和對擴增產(chǎn)物的進一步分析，包括核酸探針雜交、RFLP分析、序列分析等。目前主要應用的有PCR聯(lián)合PCR產(chǎn)物分析和實時熒光PCR，其目標基因常見選用MAP基因組插入序列IS900和結(jié)構(gòu)基因F57。IS900以高拷貝（15~20 copies）的形式存在于MAP基因組中，由于在其它分枝桿菌基因組中發(fā)現(xiàn)了與IS900高度同源的序列，對IS900 PCR檢測陽性的結(jié)果應進行測序等進一步分析確證[20]。我國發(fā)布的MAP實時熒光PCR方法以F57為目標基因（GB/T 27637—2011）。歐美國家廣泛采用了PCR等核酸檢測方法對奶制品進行MAP污染監(jiān)測[21-22]?？刹杉瘎游锛S樣、血樣、奶樣等，進行病原菌核酸檢測。其中，糞樣等基質(zhì)復雜的樣品的預處理和病原菌核酸提取效率，對PCR等核酸檢測結(jié)果有較大影響。

2.3 進出境檢疫技術(shù)探討

受檢疫周期所限，牛羊副結(jié)核進出境檢疫一般采用ELISA、皮試法，一般不采用培養(yǎng)法，PCR等核酸檢測方法目前主要用于對初篩檢測結(jié)果的確證。瓊擴、補體結(jié)合試驗方法由于缺乏試劑、操作繁瑣、準確性不理想等因素，已逐漸淘汰。根據(jù)現(xiàn)行雙邊檢疫和衛(wèi)生要求，我國對進境牛羊的副結(jié)核檢疫主要采用禽型PPD皮試和ELISA方法。

在副結(jié)核進出境檢疫技術(shù)的運用方面，需關(guān)注兩個問題：（1）試劑的選用和驗證。目前，國家層面尚缺乏對PPD試劑和副結(jié)核抗體ELISA檢測試劑盒的評價和驗證信息，難于判斷因試劑質(zhì)量差異對檢疫結(jié)果造成的影響。對于羊駝、駱駝等不常見的物種、能否采用常規(guī)用于檢測牛羊的ELISA試劑盒，尚缺乏必要的技術(shù)信息和用于驗證試劑盒的標準物質(zhì)。（2）對于皮試、ELISA檢測陽性結(jié)果，尚無明確規(guī)定要進行確證檢測以及如何進行確證。根據(jù)現(xiàn)行的雙邊檢疫和衛(wèi)生要求議定書，若采用規(guī)定的皮試或ELISA方法檢出陽性，則可剔除陽性動物。但當初篩檢測出現(xiàn)異常高比例陽性結(jié)果時，往往給進出境檢疫工作帶來被動。

建議如下：（1）組織試劑質(zhì)量驗證評估，收集并公布相關(guān)試劑品牌的質(zhì)量評估和驗證信息，提供選用指南；（2）對于不能確定適用血清學試劑的特殊動物種類，采用皮試聯(lián)合PCR等核酸檢測方法；對于不適宜實施皮試的動物，直接采用PCR等核酸檢測方法，活體采集糞樣或腸道拭子、全血樣品進行檢測；（3）如果能夠獲得試劑，可采用瓊擴、補體結(jié)合試驗等不受動物種屬類別限制的血清學檢測方法；（4）對于皮試、ELISA等抗體檢測陽性結(jié)果，鼓勵采用PCR等核酸檢測方法進行病原菌確證檢測，除對動物個體采樣，還應采集隔離或飼養(yǎng)場所環(huán)境樣本。

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（責任編輯：朱迪國）

A Review on Research of Mycobacterial Diseases of Ruminants and Application of Their Entry-exit Quarantine Techniques

Chen Ru
（Guangdong Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510623）

Mycobacterial diseases，such as Bovine tuberculosis and Paratuberculosis，have brought serious harm to global animal husbandry，which are important animal diseases in international trade. The aetiological studies and diagnosis technologies of the two diseases were reviewed in terms of etiology，detection methods and their applications in this paper. Combined with the practice of entry-exit animal inspection and quarantine in China，the applications of quarantine technology of the above epidemic diseases were discussed. Suggestions were put forward，in view of specif i c situations of different animal species and the selection of diagnostic methods and reagents.

ruminant；Bovine tuberculosis；Paratuberculosis；Mycobacterium；entry-exit quarantine

S852.61+8

A

：1005-944X（2017）07-0080-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.023