孫學(xué)強，邵衛(wèi)星，張如民，南文龍，張興進，宮楓舉，張秀娟，劉 爽

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450121）

三種感染動物陽性血清與口蹄疫病毒重組非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)原性

孫學(xué)強1，2，邵衛(wèi)星1，2，張如民3，南文龍1，張興進2，宮楓舉2，張秀娟1，劉 爽1

（1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，山東青島 266114；3. 鄭州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州 450121）

本試驗通過生物信息學(xué)技術(shù)比對分析GenBank中口蹄疫病毒（A型、O型和亞洲1型）非結(jié)構(gòu)蛋白的保守序列，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性，優(yōu)化合成了非結(jié)構(gòu)蛋白基因，經(jīng)過測序和轉(zhuǎn)化，篩選到能夠表達重組非結(jié)構(gòu)蛋白的陽性重組菌株。經(jīng)過Western-blot試驗，證明表達的重組非結(jié)構(gòu)蛋白能分別與口蹄疫病毒感染的牛、羊和豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。該重組蛋白待進一步驗證后，可用于口蹄疫病毒感染動物的鑒別檢測試劑盒研究。

口蹄疫病毒；感染血清；重組非結(jié)構(gòu)蛋白；反應(yīng)原性

口蹄疫是全球性最重要的動物健康問題之一，在世界大部分地區(qū)時有發(fā)生，是世界動物衛(wèi)生組織（OIE）規(guī)定的須通報疫病?？谔阋卟《緦儆谖NA病毒科（Picornaviridae）口蹄疫病毒屬（Aphthovirus），有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asia1型7個血清型[1]。口蹄疫病毒的基因組由5′UTR、ORF和3′UTR及PolyA組成，全長約8 500 nt，開放讀碼框架區(qū)（ORF，Open Reading Frame）編碼1個多聚蛋白，依次為Lpro蛋白編碼區(qū)、P1區(qū)、P2區(qū)和P3區(qū)[2-3]，基因組結(jié)構(gòu)為VPg_5_ UTR[Lpro/1A—1B—1C—1D—2Anpgp/2B—2C/3A—3B—3C—3D]3_UTR—polyA。用3ABC基因編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白（Non-structural protein，NSP）為抗原，檢測動物體內(nèi)的NSP抗體是一種很好的區(qū)分感染動物和疫苗免疫動物的診斷方法[4]。檢測3ABC抗體，免疫動物3ABC抗體陰性，感染動物則為陽性[1]。

大多數(shù)發(fā)展中國家一直都在通過注射滅活疫苗的辦法來控制該病的流行。去除滅活疫苗中的非結(jié)構(gòu)蛋白成為質(zhì)量控制的關(guān)鍵[5]。隨著口蹄疫滅活疫苗純化工藝的發(fā)展[6]，研發(fā)并應(yīng)用以口蹄疫病毒NSP為抗原檢測動物血清中的特異性抗體，以區(qū)別臨床病例的感染和免疫，對于口蹄疫的防控意義重大。本試驗通過基因優(yōu)化并合成了表達口蹄疫病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因，轉(zhuǎn)化表達宿主菌。重組陽性克隆經(jīng)過誘導(dǎo)后表達的重組NSP能夠與牛、羊和豬的病毒感染陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。該重組蛋白是研究開發(fā)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ELISA抗體檢測試劑盒的良好候選抗原。

1 材料和方法

1.1 血清、酶和基因合成

經(jīng)過病毒中和試驗驗證的牛口蹄疫病毒感染陽性血清、羊口蹄疫病毒感染陽性血清、豬口蹄疫病毒感染陽性血清，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供；口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Taq酶、限制酶，購自寶生物（大連）工程有限公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；硝酸纖維素膜及電泳試劑等，為Sigma公司產(chǎn)品；核酸膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、增強型HRPDAB底物顯色試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；表達載體pET-28a，為本實驗室保存；酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗，購自英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因優(yōu)化合成及鑒定。以NCBI公布口蹄疫病毒（A型、O型和亞洲1型）的非結(jié)構(gòu)蛋白序列通過BLASTP比對，以保守蛋白序列為重組目的蛋白，根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進行優(yōu)化DNA序列，在5′端加入NdeI酶切位點和6His標(biāo)簽蛋白序列，在3′端依次加入終止密碼子和HindIII酶切位點序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆至表達載體pET-28a。重組表達載體結(jié)構(gòu)見圖1。重組表達質(zhì)粒鑒定引物FP（5′AATACGACTCACTATAGGG3′）和RP（5′TGCTAGTTATTGCTCAGCGG3′）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

圖1 重組表達載體圖譜

1.2.2 重組表達載體的鑒定和重組菌株轉(zhuǎn)化。將含有重組表達載體的大腸桿菌接種LB液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)過夜后，取2 μL菌液用FP和RP進行PCR擴增并電泳鑒定。取2 mL菌液，12 000 r/min 離心120 s，菌體后加入500 μL溶液Ⅰ，充分混勻；加入500 μL溶液Ⅱ后輕柔顛倒混勻至液體清亮；加入700 μL溶液Ⅲ混勻，4 ℃ 13 000 r/min離心 10 min；將上清液體移至吸附柱中，離心60 s；棄濾液，加入500 μL 70%乙醇溶液洗滌，13 000 r/min離心120 s；將吸附柱放入新EP管中，加入 30 μL 洗脫液，然后13 000 r/min 離心1 min，收集的洗脫液中即為重組表達載體。取重組表達載體質(zhì)粒10 μL、HindIII 1 μL、NdeI 1 μL、10×T Buffer 3 μL、去離子水5 μL，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。取重組質(zhì)粒2 μL加入到 100 μL 新鮮的大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，輕柔吹打混勻，冰浴30 min；然后置42 ℃水浴中熱休克90 s，迅速置冰中冷卻2~3 min；加入800 μL LB培養(yǎng)基，37 ℃ 120 r/min 震蕩培養(yǎng)45 min；取100 μL菌液，涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)16 h。挑取轉(zhuǎn)化后在抗性平板上生長的單菌落，接種于含有卡那霉素抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 h后，取2 μL菌液用FP和RP進行PCR擴增并電泳鑒定。

1.2.3 非結(jié)構(gòu)蛋白的誘導(dǎo)表達。將鑒定正確的含有重組表達質(zhì)粒的BL21（DE3）宿主菌的陽性克隆菌株按1:50倍接種于10 mL含1:1 000稀釋的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)7 h；然后取5 mL加入IPTG至終濃度1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)進行誘導(dǎo)表達。誘導(dǎo)6 h后，所有樣品各取0.5 mL，13 000 r/min離心60 s，移出上清液加入蛋白電泳載樣緩沖液；沉淀細菌加入40 μL PBS重懸沉淀，充分混勻后加入蛋白電泳載樣緩沖液；100 ℃水浴10 min，13 000 r/min離心5 min，各取10 μL上清進行SDS-PAGE檢測。

1.2.4 三種動物感染陽性血清與重組蛋白的反應(yīng)原性。按照常規(guī)方法制備12%分離膠和5%的濃縮膠，每孔上樣5 μL，80 V進行電泳濃縮，當(dāng)溴酚藍進入分離膠后改變電壓為120 V。采用半干法轉(zhuǎn)印至NC膜，用5%的脫脂奶封閉過夜；將樣品轉(zhuǎn)印膜分別在含有20 μL酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗、?？谔阋卟《靖腥娟栃匝濉⒀蚩谔阋卟《靖腥娟栃匝搴拓i口蹄疫病毒感染陽性血清的20 mL TBST中37 ℃孵育1 h后，用TBST洗滌2次，每次10 min；三種陽性血清孵育的轉(zhuǎn)印膜在含有20 μL HRP-SPA的TBST中37℃孵育1 h，然后用TBST洗滌2次，用DAB顯色約30 s后終止反應(yīng)，晾干觀察。

2 結(jié)果

2.1 重組表達載體的合成目的基因序列分析

根據(jù)測序報告，將優(yōu)化合成的非結(jié)構(gòu)蛋白基因序列進行翻譯；對翻譯后的蛋白序列經(jīng)過GenBank比對，發(fā)現(xiàn)與口蹄疫病毒A型、O型和Asia 1型的非結(jié)構(gòu)蛋白同源性達到96%。

2.2 重組表達載體的PCR和酶切鑒定

將含有重組表達載體的大腸桿菌接種LB液體培養(yǎng)基37 ℃培養(yǎng)過夜后，取2 μL菌液用FP和RP進行PCR擴增，對產(chǎn)物經(jīng)過電泳后在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，結(jié)果出現(xiàn)特定長度的擴增片段。對培養(yǎng)物小提質(zhì)粒后，用HindIII和NdeI雙酶切，產(chǎn)物經(jīng)過電泳也出現(xiàn)與PCR鑒定相同長度的目的基因片段（圖2）。

圖2 重組表達載體的PCR和酶切鑒定電泳圖譜

2.3 重組菌株轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達

將鑒定正確的含有重組表達質(zhì)粒，以熱激法轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)BL21（DE3）宿主菌，經(jīng)過PCR鑒定，在陽性克隆菌株中出現(xiàn)特定長度的擴增條帶。將陽性克隆菌株接種于10 mL含卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)7 h后，用 IPTG誘導(dǎo)6 h，制備誘導(dǎo)后的菌體和上清蛋白樣品，然后進行SDS-PAGE。凝膠經(jīng)過染色后觀察發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)前的菌體和上清以及誘導(dǎo)后的上清均未出現(xiàn)表達條帶，誘導(dǎo)后菌體出現(xiàn)豐度較高的表達條帶（圖3）。

圖3 重組陽性克隆誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS-PAGE圖譜

2.4 三種動物感染陽性血清與重組非結(jié)構(gòu)蛋白的反應(yīng)結(jié)果

將誘導(dǎo)后的培養(yǎng)物上清和菌體蛋白電泳樣品進行適當(dāng)稀釋后，再次進行SDS-PAGE電泳。用半干法將PAGE膠上的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜，進行western-blot試驗。轉(zhuǎn)印的NC膜經(jīng)過封閉后分別與酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗、牛口蹄疫病毒感染陽性血清、羊口蹄疫病毒感染陽性血清、豬口蹄疫病毒感染陽性血清各20 μL進行反應(yīng)，最后參照增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒說明書進行顯色。觀察顯色條帶，發(fā)現(xiàn)酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗與重組非結(jié)構(gòu)蛋白出現(xiàn)雜交條帶，表明構(gòu)建、鑒定和篩選的重組質(zhì)粒以及含有重組質(zhì)粒的菌株能夠表達完整的重組目的蛋白；表達的重組蛋白與牛、羊和豬口蹄疫病毒感染陽性血清反應(yīng)均出現(xiàn)雜交條帶，證明篩選的陽性克隆菌株能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生的重組非結(jié)構(gòu)蛋白能夠與牛、羊、豬口蹄疫病毒感染陽性血清發(fā)生反應(yīng)，而且反應(yīng)原性良好（圖4）。

圖4 牛、豬、羊感染陽性血清及酶標(biāo)6His標(biāo)簽蛋白單抗與重組非結(jié)構(gòu)蛋白圖譜的western-blot圖譜

3 討論

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸傳染性動物疫病。目前，我國仍是口蹄疫危害較為嚴重的國家之一，流行情況比較復(fù)雜。O型、Asia 1型、A型3種血清型口蹄疫病毒并存，豬牛羊等易感動物都有感染。我國當(dāng)前主要的口蹄疫預(yù)防方針是實行區(qū)域化管理，嚴格落實免疫預(yù)防、監(jiān)測凈化等防治措施。在監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查方面，縣級動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)以抗體監(jiān)測和病原學(xué)初篩為主；地市級和省級動物疫病預(yù)防控制機構(gòu)以病原學(xué)監(jiān)測為主[7]。因此，口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白的檢測試劑對于口蹄疫防控工作至關(guān)重要，研究開發(fā)能夠滿足需求的檢測試劑盒意義重大。

本試驗通過基因優(yōu)化合成獲得非結(jié)構(gòu)蛋白的目的基因，未采用提取口蹄疫病毒RNA通過RTPCR獲得目的基因。這不但避免了直接操作一類病原微生物存在的生物安全風(fēng)險，同時根據(jù)遺傳密碼子的簡并性和大腸桿菌密碼子偏好性，也提高了目的基因能夠在大腸桿菌宿主菌中的表達效率。本試驗中選擇3種感染動物的陽性血清對重組表達蛋白進行免疫雜交，其試驗結(jié)果和篩選到的陽性克隆更有利于下游的試驗設(shè)計和開展。但是，對于所用的3種動物陽性血清，由于條件限制，未能確定其感染的口蹄疫病毒亞型。對于該重組蛋白與3種易感動物感染口蹄疫病毒不同亞型的陽性血清以及免疫動物的陽性血清的反應(yīng)原性，已通過建立ELISA方法得到了進一步驗證，相關(guān)研究結(jié)果和數(shù)據(jù)另文發(fā)表。

利用口蹄疫病毒重組NSP建立檢測方法的研究報道很多，有的是用病毒基因組直接提取核酸克隆NSP基因進行原核表達[8]，有的用酵母細胞進行表達[9]，有的建立了ELISA抗體檢測方法[10-11]，有的研發(fā)膠體金試紙條[12]，有的建立了斑點免疫金滲濾法[13]，而且有報道國內(nèi)生產(chǎn)的口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體檢測試劑盒可以用于?？谔阋哐鍖W(xué)篩選性試驗[14]。本試驗獲得的表達口蹄疫重組非結(jié)構(gòu)蛋白能夠與牛、羊和豬的病毒感染陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，可以作為研究開發(fā)口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白多種抗體檢測試劑盒的良好候選抗原。

[1] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 5版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013：555.

[2] 劉慶軍，張永光. 口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)及其功能[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2005（5）：1-5.

[3] 孫靖，于海峰. 口蹄疫病毒基因組結(jié)構(gòu)及功能[J]. 滄州師范專科學(xué)校學(xué)報，2007（4）：116-118.

[4] 朱詠梅，朱來華，鄭小龍，等. 口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白研究進展[J]. 中國動物檢疫，2011（5）：83-86.

[5] 陳君彥，趙麗霞，關(guān)平原. 關(guān)于通過監(jiān)測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體來評價口蹄疫疫苗純度的研究進展[J]. 國外畜牧學(xué)（豬與禽），2016（4）：67-69.

[6] 趙麗霞，關(guān)平原，陳君彥，等. 通過檢測非結(jié)構(gòu)蛋白抗體評價口蹄疫疫苗純度的研究[J]. 中國獸藥雜志，2015（4）：17-20.

[7] 農(nóng)業(yè)部. 關(guān)于印發(fā) 《國家口蹄疫防治計劃（2016-2020年）》的通知：農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2016〕39號[A]. 北京：農(nóng)業(yè)部，2016-08-22.

[8] 曹軼梅，劉在新，盧曾軍，等. 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因3ABC在大腸桿菌中的高效表達[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004（1）：115-118.

[9] 李夏瑩，鄭鷺飛，張秀杰，等. 口蹄疫病毒研究進展 [J].中國畜牧獸醫(yī)，2015（7）：1910-1916.

[10] 王娜. 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3A單抗結(jié)合肽的鑒定及阻斷ELISA方法的建立[D]. 蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[11] 祝秀梅，盧曾軍，胡永浩，等. 檢測豬血清口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體ELISA方法的建立[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008（1）：33-37.

[12] 吳磊. 口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C3AB抗體膠體金檢測試紙的研制[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2010.

[13] 孔繁德，朱文釧，林祥梅，等. 檢測口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3AB抗體的斑點免疫金滲濾法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2010（7）：717-721.

[14] 王玉玲，張俊哲，王可，等. 國內(nèi)外口蹄疫非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC抗體ELISA檢測方法的比較[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2015（8）：79-81.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Reactionogenicity of Foot-and-mouth Disease Virus Recombinant Non-structural Protein against the Positive Sera of Infected Bovine，Goat and Swine

Sun Xueqiang1，2，Shao Weixing1，2，Zhang Rumin3，Nan Wenlong1，Zhang Xingjin2，Gong Fengju2，Zhang Xiujuan1，Liu Shuang1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Qingdao Regen Diagnostics Development Center，Qingdao，Shandong 266114；3. Zhengzhou Technical College，Zhengzhou，Henan 450121）

The conserved non-structural protein（NSP）sequence of Foot-and-mouth disease virus（type A，type O and type Asia 1）was conf i rmed by blastp from GenBank. The DNA sequence coding the truncated conserved NSP was optimized according to the bias ofE. coli. It was synthesized and cloned to expression vector. After sequencing and transformation，the positive recombinant strains expressing recombinant NSP were screened. Using western-blot，it was conf i rmed that the recombinant truncated NSP could react against with the positive sera of infected bovine，goat and swine. So that，the recombinant truncated NSP could be used as an antigen to develop the DIVA diagnostics kits.

FMDV；infected positive sera；recombinant non-structural protein；reactionogenicity

S852.65

：B

：1005-944X（2017）07-0092-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.026

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項（2012FY111000）