王楷宬，邱 源，紀(jì)海旺，彭 程，莊青葉，王 通，王素春，于建敏，許榮強(qiáng)，陳繼明

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 嶗山區(qū)王哥莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，山東青島 266105）

通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒基因組及其高通量測(cè)序

王楷宬1，邱 源1，紀(jì)海旺2，彭 程1，莊青葉1，王 通1，王素春1，于建敏1，許榮強(qiáng)1，陳繼明1

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2. 嶗山區(qū)王哥莊街道農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，山東青島 266105）

為探索使用高通量測(cè)序方法測(cè)定甲型流感病毒的基因組，設(shè)計(jì)了一對(duì)通用引物進(jìn)行甲型流感病毒全基因組的RT-PCR擴(kuò)增，并分析了該方法的敏感性。結(jié)果顯示，該方法能夠擴(kuò)增的甲型流感病毒多種亞型的全部8個(gè)節(jié)段的基因，其擴(kuò)增敏感性為100 pg RNA。

甲型流感病毒；通用引物；基因組；高通量測(cè)序

甲型流感病毒屬于正黏病毒科流感病毒屬，為有包膜分節(jié)段的單負(fù)鏈RNA 病毒。其基因組由8個(gè)單股負(fù)鏈RNA片段組成，每個(gè)基因在3′末端和5′末端都帶有12～13個(gè)保守核苷酸序列。這8個(gè)片段可編碼10種蛋白，其中8個(gè)蛋白（HA、NA、PB1、PB2、NP、M1、M2和PA）為結(jié)構(gòu)蛋白，NS1和NS2為非結(jié)構(gòu)蛋白，位于宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中[1]。根據(jù)HA 和NA 抗原性的差異，甲型流感病毒可分為若干亞型，迄今已發(fā)現(xiàn)有18種HA亞型（H1～H18）和11種NA亞型（N1～N11）[2-4]。任何一對(duì)HA 和NA 均可組合成一個(gè)亞型，如H1N1、H5N1、H7N9等。

甲型流感病毒能產(chǎn)生低保真RNA聚合酶。其可引起流感病毒的高突變率以及基因重組，可使流感病毒呈現(xiàn)分子多樣性，使每個(gè)病毒亞型可進(jìn)化為多個(gè)分支[5]。由于甲型流感病毒亞型多、突變率高、易發(fā)生重配，因此對(duì)流行毒株進(jìn)行基因組分析尤為重要。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，采用高通量測(cè)序方法進(jìn)行甲型流感病毒基因組的測(cè)定[6]，已被科研人員廣泛接受。已經(jīng)有研究人員報(bào)道，在1個(gè)RT-PCR反應(yīng)中，使用1對(duì)通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒所有8個(gè)基因節(jié)段的方法，從而使得流感病毒全基因組的測(cè)序更為簡(jiǎn)單[7]。傳統(tǒng)測(cè)序方法雖然經(jīng)濟(jì)高效，但僅能測(cè)定某一特異性擴(kuò)增片段，且不能測(cè)定準(zhǔn)種[8]。而我國(guó)現(xiàn)在用于高通量測(cè)序平臺(tái)的甲型流感病毒基因組擴(kuò)增試劑主要依賴進(jìn)口，購(gòu)買該試劑的費(fèi)用較高。本文參照文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)了1對(duì)通用引物進(jìn)行甲型流感病毒全基因的RT-PCR擴(kuò)增，并分析了該方法的敏感性。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion Xpress Plus Fragment Library Kit、Ion PGM Template OT2 200 Kit、Ion PGM Sequencing 200 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2% Agarose、Ion 318 Chip Kit V2、 Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Ion Xpress Batcode Aaptors、Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑，均購(gòu)自Life technologies公司；超凈工作臺(tái)（Forma Scientifc）；移液器（Eppendorf）；孵化器（德州誠(chéng)信孵化設(shè)備有限公司）；高速臺(tái)式離心機(jī)（Heraeus Biofuge primoR）；PCR擴(kuò)增儀（Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600）。

1.2 毒株和核酸提取

各亞型甲型流感毒株由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室保存，毒株詳細(xì)信息見表1。病毒株接種9～11日齡雞胚，72小時(shí)內(nèi)收取雞胚尿囊液進(jìn)行病毒核酸RNA提取。按照說(shuō)明書操作，使用RNA提取試劑盒（QIAamp Viral RNA Mini Kit，Qiagen）提取病毒RNA，并使用Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑測(cè)定RNA濃度。

表1 禽流感病毒株信息

1.3 引物合成

按 照 文 獻(xiàn)[6]合 成 引 物。MBTuni-12：5'-ACGCGTGATCAGCAAAAGCAGG；MBTuni-13：5'-ACGCGTGATCAGTAGAAACAAGG。

1.4 甲型流感病毒基因組擴(kuò)增

使 用 PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2（Takara）進(jìn)行甲型流感病毒全基因擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×1 Step Buffer 25 μL，MBTuni-12（10 pM）和MBTuni-13（10 pM）各2 μL，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 2 μL，RNA 10 μL，RNase Free dH2O 9 μL。反應(yīng)條件 ：45 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h；95 ℃4 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行鑒定。

1.5 文庫(kù)構(gòu)建

使用AMPure XP核酸純化磁珠（Beckman）對(duì)擴(kuò)增得到的甲型流感病毒基因組進(jìn)行擴(kuò)增，將純化后的全基因cDNA稀釋成35 μL中含有200 ng DNA的溶液，使用Ion Xpress Plus Fragment Library Kit將病毒全基因組DNA打斷為200 bp的片段，加入含有Barcode的接頭，構(gòu)建為PGM測(cè)序儀可識(shí)別的DNA文庫(kù)。

1.6 測(cè)序

將DNA文庫(kù)稀釋為26 pM，應(yīng)用Ion PGM Template OT2 200 Kit對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序前的樣品處理。將處理后的樣品加樣至Ion 318 芯片，置于PGM測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序序列經(jīng)PGM自帶的FluAnalysis（v4.0）軟件進(jìn)行序列拼接。

1.7 敏感性試驗(yàn)

以A/avian/China/A32/2012的基因組RNA為模板，稀釋成含有1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、0.1 pg/μL和0.01 pg/ μL的RNA溶液，使用PrimeScript?One Step RT-PCR Kit Ver.2） 和 引 物MBTuni-12/ MBTuni-13進(jìn)行甲型流感病毒的全基因擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 流感病毒全基因組擴(kuò)增及文庫(kù)構(gòu)建

使用該對(duì)引物能夠擴(kuò)增出9個(gè)毒株（8個(gè)HA亞型和3個(gè)NA亞型）的目的條帶，得到該病毒全基因的所有節(jié)段擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。純化后的cDNA濃度均能滿足測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建的需要，經(jīng)稀釋后構(gòu)建成含有Barcode接頭的200 bp DNA文庫(kù)。

圖1 甲型流感病毒基因組擴(kuò)增結(jié)果

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，該方法能夠完成這些亞型的全基因組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)拼接后可覆蓋甲型流感病毒的所有8個(gè)節(jié)段。各毒株每個(gè)節(jié)段的平均測(cè)序深度見表2。包括各節(jié)段的5′和3′端序列，所有毒株的節(jié)段至少平均被測(cè)199次（A/avian/China/P174/2013的PA基因）。綜合分析所有9個(gè)毒株8個(gè)節(jié)段的平均測(cè)序深度發(fā)現(xiàn)：M基因的平均測(cè)序深度最大，為5 533；PA基因的平均測(cè)序深度最小，為1 497。通過FluAnalysis（v4.0）軟件對(duì)各毒株的HA和NA亞型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)除第8和第9株通過高通量測(cè)序鑒定的亞型與常規(guī)檢測(cè)結(jié)果不同外，其余均一致（表2）。

表2 毒株各節(jié)段的測(cè)序深度

2.3 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

不同濃度的A/avian/China/A32/2012的基因組RNA，經(jīng)使用PrimeScript? One Step RT-PCR Kit Ver.2和引物MBTuni-12/ MBTuni-13進(jìn)行甲型流感病毒全基因擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物毛細(xì)管電泳結(jié)果見圖2。由圖2可見，反應(yīng)體系中加入10 μL濃度為10 pg/μL的RNA（100 pg）仍能檢測(cè)到清晰的所有流感病毒節(jié)段的條帶。

圖2 不同濃度的引物RT-PCR檢測(cè)甲型流感病毒敏感性的比較

3 討論

甲型流感病毒全基因測(cè)序?qū)α私饬鞲胁《镜姆肿由飳W(xué)特性、基因重配機(jī)制、準(zhǔn)種分析[14]等具有十分重要的意義。甲型流感病毒全基因測(cè)定的傳統(tǒng)方法常是采用每個(gè)基因的特異性引物擴(kuò)增的方法，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)直接測(cè)序或克隆測(cè)序得到全基因序列。這種方法操作繁瑣，且針對(duì)某些亞型的甲型流感病毒需要采用亞型特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增。這在毒株亞型未知的情況下，更會(huì)加大工作量。為了解決這些問題，使用通用的一對(duì)引物，一步RT-PCR擴(kuò)增全部亞型的全基因方法被逐步建立和應(yīng)用[1，9]，但將全部8個(gè)節(jié)段的擴(kuò)增產(chǎn)物在一個(gè)反應(yīng)體系中進(jìn)行測(cè)序仍是一項(xiàng)復(fù)雜工作。隨著高通量測(cè)序的發(fā)展，這種混合樣品的測(cè)序問題被逐步得到解決，從而使得甲型流感病毒的全基因測(cè)序技術(shù)得到進(jìn)一步發(fā)展[6]。采用高通量測(cè)序，可以開展甲型流感病毒的監(jiān)測(cè)[10]、亞型鑒定[11]、全基因測(cè)序與進(jìn)化分析[12]，以及突變頻率[13]和準(zhǔn)種分析[14]等工作。

我國(guó)用于甲型流感病毒全基因高通量測(cè)序的配套試劑全部依賴進(jìn)口，國(guó)內(nèi)鮮見有關(guān)通用引物擴(kuò)增甲型流感病毒全基因的報(bào)道。本文依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，建立了此種通用引物擴(kuò)增方法。結(jié)果顯示，所采用的建庫(kù)與測(cè)序方法能夠測(cè)定甲型流感病毒的全基因，并且測(cè)序深度較大，能滿足序列分析的需要。本實(shí)驗(yàn)在一次測(cè)序中完成了9種亞型甲型流感病毒的全部8個(gè)基因的測(cè)序，并分析出各毒株的HA和NA亞型。但常規(guī)測(cè)序判定為H10和H11的兩株病毒，在本實(shí)驗(yàn)中卻被分別分析為H1和H10，此結(jié)果產(chǎn)生的原因?qū)?huì)在下一步的研究中分析。此項(xiàng)技術(shù)的建立，將提高我國(guó)甲型流感病毒監(jiān)測(cè)和分析的能力和效率，減少我國(guó)相關(guān)試劑的購(gòu)買費(fèi)用，待技術(shù)成熟后，可向科研院所和疾病防控機(jī)構(gòu)推廣。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Genome Amplification of Influenza A Virus by Universal Primers and Sequencing by High-throughput Sequencing

Wang Kaicheng1，Qiu Yuan1，Ji Haiwang2，Peng Cheng1，Zhuang Qingye1，Wang Tong1， Wang Suchun1，Yu Jianmin1，Xu Rongqiang1，Chen Jiming1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Agricultural Service Center of Wanggezhuang Street in Laoshan District，Qingdao，Shandong 266105）

To sequence the genome of infuenza A virus by high-throughput sequencing，a pair of universal primers was designed to amplify the genome by RT-PCR. The sensibility of the method was also analyzed. The results showed that all the 8 genes of several subtypes infuenza A virus could be amplifed，and the lowest detection limit was 100 pg RNA.

infuenza A virus；universal primers；genome；high-throughput sequencing

book=90,ebook=96

S851.3

A

1005-944X（2017）01-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.025

科技部科技基礎(chǔ)性專項(xiàng)（SQ2012FY3260033）；中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金（2015IF-0004FF）

陳繼明