（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

雞腸道內(nèi)乳酸菌的分離鑒定及體外抑菌試驗(yàn)

劉 鴿，劉絨歡，劉升蘭，張培生，于會舉，張 倩，屈勇剛

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832003）

為獲得雞腸道內(nèi)抑菌效果好、適應(yīng)性強(qiáng)的乳酸菌，從健康雞小腸內(nèi)容物中分離乳酸桿菌，并對其進(jìn)行生化鑒定。結(jié)果成功從雞小腸中分離出6株細(xì)菌。通過革蘭氏染色和生化鑒定，發(fā)現(xiàn)這6株細(xì)菌分別是微小乳酸菌（L.minor）、約氏乳桿菌（L.johnsonii）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、腸乳桿菌（L.intestinalis）、嗜酸乳桿菌（L.acidlophilus）、植物乳桿菌（L.plantarum）。對分離到的6 株乳酸菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明腸乳桿菌（L.intestinalis）對大腸桿菌有一定的抑菌作用。該研究為后期開發(fā)益生菌制劑奠定了一定的基礎(chǔ)。

雞；乳酸桿菌；分離鑒定；體外抑菌試驗(yàn)

益生菌在1965年首次被定義為一種微生物分泌的，可以刺激另一種微生物生長的物質(zhì)。1989年Fuller[1]把益生菌定義為在一定程度上可對宿主起到有益作用的活微生物制劑。1992年Fuller[2]又詳細(xì)描述了益生菌制劑應(yīng)符合以下標(biāo)準(zhǔn)：要有存活能力，達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)；活性穩(wěn)定，便于控制；在腸內(nèi)或其他生存環(huán)境內(nèi)，具有存活能力（不一定繁殖）；必須對宿主產(chǎn)生有益作用；無毒、無害、安全、無副作用。

乳酸菌是一種研究較多的益生菌，其應(yīng)用早、制劑多。乳酸菌產(chǎn)生的特殊抗生素（酸菌素）可抑制沙門氏菌和大腸桿菌的生長。乳酸菌類益生菌的應(yīng)用在近十年發(fā)展很快，是動物營養(yǎng)學(xué)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。雞大腸桿菌病是影響?zhàn)B禽業(yè)的主要細(xì)菌病之一，常給養(yǎng)殖企業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于長期飼喂抗生素，導(dǎo)致了耐藥菌株的生成以及畜禽產(chǎn)品中嚴(yán)重的藥物殘留，從而威脅人類健康。乳酸菌類益生菌制劑避免了抗生素長期使用而出現(xiàn)的毒副作用及耐藥性或抗藥性問題，可防治微生態(tài)平衡失調(diào)，同時(shí)可促進(jìn)畜禽生長發(fā)育，提高飼料消化、吸收和轉(zhuǎn)化的效率，增加肉蛋產(chǎn)率，而且產(chǎn)品中無殘留污染，符合綠色食品要求。目前，關(guān)于乳酸菌類益生菌的研究已成為國內(nèi)外熱點(diǎn)?；谏鲜銮闆r，本試驗(yàn)擬分離并馴化雞腸道益生菌，為生物防治雞細(xì)菌性疾病奠定基礎(chǔ)，為養(yǎng)禽業(yè)和科學(xué)研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源。健康雞的腸道內(nèi)容物，從石河子市金馬市場購買。

1.1.2 培養(yǎng)基和試劑盒。營養(yǎng)肉湯；營養(yǎng)瓊脂；分離培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng)基，北京索萊寶科技，加0.75% CaCO3和營養(yǎng)瓊脂）；菌種保藏及傳代培養(yǎng)基（MRS 固體培養(yǎng)基，配法和分離培養(yǎng)基配法相同，不加CaCO3）；生化鑒定培養(yǎng)基；乳酸菌成套生化鑒定管；快速革蘭氏染色液。

1.1.3 指示菌來源。雞致病性大腸桿菌由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實(shí)驗(yàn)室提供。指示菌放于超低溫冰箱中，且保存完好，沒有被污染。

1.1.4 主要儀器。電子天平（北京賽多麗斯儀器廠）；調(diào)溫電熱套（山東省鄴城永興儀器廠）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；光學(xué)顯微鏡（CX21FS1，日本）；凈化工作臺（上海鴻都電子科技有限公司）；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海智城）；移液器（德國 Eppendorf）；厭氧罐。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集。從石河子市金馬屠宰市場采集雞的腸道，在實(shí)驗(yàn)室立即用無菌生理鹽水沖洗至無肉眼可見的食糜后，刮取腸道粘膜1 g，放于無菌生理鹽水中，依次用無菌生理鹽水進(jìn)行10倍梯度稀釋，靜置5 min后，取上清液，用以分離乳酸桿菌。

1.2.2 菌種分離。各取102、107、108、109、1010、1011稀釋度的上清液，分別滴加到加0.75% CaCO3的MRS固體選擇培養(yǎng)基上，且涂布均勻。把培養(yǎng)基小心裝入?yún)捬豕蓿梢圆捎脿T缸法），放入37 ℃的恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h左右。認(rèn)真觀察待檢菌落的形成、發(fā)育和溶鈣環(huán)的大小。挑取有明顯溶鈣環(huán)的單個(gè)菌，在MRS選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行厭氧培養(yǎng)。在37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌生長情況。再次接種培養(yǎng)，直到形成形態(tài)均一、分布均勻的單一菌落為止。

1.2.3 乳酸菌的鑒定

1.2.3.1 革蘭氏染色[3]。挑選加入0.75% CaCO3的MRS培養(yǎng)基上的溶鈣單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭氏染色試驗(yàn)，在鏡下觀察分離菌的形態(tài)。染色為紅色的菌體為陰性，染色為藍(lán)色的菌體為陽性。選擇陽性菌，以及染色深淺不一、形態(tài)各異的桿菌進(jìn)行純化和革蘭氏染色，選出陽性菌株做進(jìn)一步鑒定。

1.2.3.2 生化試驗(yàn)[4-5]

1.2.3.2.1 接觸酶試驗(yàn)。挑選MRS加鈣培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落于無菌的載玻片上，在每個(gè)單個(gè)菌上滴加一滴3%的H2O2溶液，混合均勻。如果發(fā)現(xiàn)有氣泡，則判為陽性，無氣泡則為陰性。

1.2.3.2.2 糖發(fā)酵試驗(yàn)。從瓊脂的純培養(yǎng)物上取少量菌，接種于糖發(fā)酵管培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)48 h，及時(shí)觀察培養(yǎng)液的顏色。如培養(yǎng)液仍為藍(lán)色為“－”，變黃色為“+”；不產(chǎn)氣為“－”，產(chǎn)氣為“+”。

1.2.3.2.3 液化明膠試驗(yàn)。試驗(yàn)菌接種后放到適溫培養(yǎng)環(huán)境下培養(yǎng)，其中兩支管作空白對照。明膠培養(yǎng)基在20℃以下時(shí)凝固，24℃以上時(shí)能自行液化。而試驗(yàn)菌株通常在高于20℃的適溫中培養(yǎng)，因此結(jié)果觀察需在低溫環(huán)境下。可把試驗(yàn)管和對照管放到冷水或冰箱中，等到對照管凝固后，及時(shí)準(zhǔn)確記錄試驗(yàn)結(jié)果。反復(fù)對比，多次觀察。若對照管凝固時(shí)，接種管液化或明膠表面出現(xiàn)凹陷小窩，則判為陽性反應(yīng)；凝固，則判為陰性反應(yīng)。

1.2.3.2.4 硫化氫試驗(yàn)。將普通濾紙裁剪成0.5～1cm 寬的紙條，長度可根據(jù)實(shí)際需要適當(dāng)調(diào)整。把紙條用5%～10%的醋酸鉛溶液浸透，烘干，在培養(yǎng)皿中滅菌后備用。接種后加醋酸鉛紙條，并用棉塞塞緊，使其懸于試管中，不能接觸到管中的液面，放置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)。紙條若變黑，則為陽性，否則為陰性。

1.2.3.3 用生化鑒定管鑒定

1.2.3.3.1 準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。用力折開安瓿瓶，放到安瓿試管架中。操作過程中注意安全，不要傷及自己和他人。如果染菌或變色，則需換用新的。

1.2.3.3.2 接種方法。直接接種法：用接種針挑取已純化的同一菌落，分別接種到相應(yīng)試驗(yàn)的生化管中。菌懸液法：取1個(gè)內(nèi)盛無菌水的試管，從純化培養(yǎng)的平板上挑取單個(gè)菌落，放入無菌水中仔細(xì)研磨，制成0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木患?xì)菌懸液，滴入相應(yīng)試管中，每管3滴。其中對固體和半固體生化管，采用穿刺接種。

1.2.3.3.3 接種后，放到（36±1）℃的恒溫箱中培養(yǎng)。使用封口膜將試管封口；封口膜在使用前可用75%酒精擦拭滅菌。

1.2.4 活菌液對致病菌的抑菌試驗(yàn)。采用瓊脂擴(kuò)散法[6-7]。把致病菌懸液均勻涂布在厚度約為4 mm的營養(yǎng)瓊脂平板上，室溫下靜置30 min，使菌液得到充分吸收。然后在瓊脂上打孔徑約5 mm的孔，封底。用制備的各菌株菌液加滿孔，置適宜溫度下培養(yǎng)24 h，測量抑菌圈直徑。本試驗(yàn)做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。判斷標(biāo)準(zhǔn)[9]：φ≤5 mm，不敏感；φ5～10 mm，低度敏感；φ10～15 mm，中度敏感；φ≥15 mm，高度敏感。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離與染色形態(tài)特征

從雞腸道中分離了6株細(xì)菌（分別標(biāo)記為1號、3號、5號、6號、7號、8號）。這6株菌在0.75%CaCO3的MRS培養(yǎng)基上長出乳白色菌落，染色鏡檢為G+桿菌，結(jié)果見表1、圖1、圖2。

表1 分離菌的染色及形態(tài)特性

2.2 生化鑒定結(jié)果

對分離得到的6株菌分別進(jìn)行過氧化氫酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、各種糖發(fā)酵試驗(yàn)及乳酸菌微管鑒定試驗(yàn)，結(jié)果見表2、表3。

圖1 純化分離菌的試驗(yàn)結(jié)果

圖2 分離菌（6號）的形態(tài)及染色特征

表2 分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果

表3 細(xì)菌微量生化鑒定管（乳酸菌）鑒定結(jié)果

根據(jù)菌落形狀大小、革蘭氏染色鏡檢特性，以及各生化反應(yīng)結(jié)果，參考《乳酸菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法》[8]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]進(jìn)行綜合判定，確定得到的純化菌株種屬。乳酸菌種的鑒定結(jié)果：1號為微小乳酸菌（L.minor），3號為約氏乳桿菌（L.johnsonii），5號為彎曲乳桿菌（L.curvatus），6號為腸乳桿菌（L.intestinalis），7號為嗜酸乳桿菌（L.acidlophilus），8號為植物乳桿菌（L.plantarum）。

2.3 體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果

6株乳酸桿菌的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果見表4。微小乳酸菌不敏感，約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌為低度敏感，彎曲乳桿菌、腸乳桿菌為中度敏感。相對來說抑菌效果最佳的是腸乳桿菌。

表4 不同乳酸菌對大腸桿菌產(chǎn)生的抑菌圈大小

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)材料是小雞的腸道粘膜。乳酸菌在動物的不同種屬、不同年齡、不同消化道部位的含量不同。雞日齡越大，腸道中的乳酸菌含量越少；雞胃和小腸中的乳酸菌含量比大腸和糞便中的多。沖洗食糜，從粘膜上分離乳酸菌就是為了避免從飼料中帶入細(xì)菌造成的影響。小雞價(jià)格便宜，體型較小，因此小雞腸道粘膜作為試驗(yàn)材料是比較理想的。

本次試驗(yàn)共從小腸粘膜中分離出6株乳酸菌。對其純化時(shí)，在37 ℃溫箱中培養(yǎng)24～36 h。如果時(shí)間過長，菌落就容易長成一片，不容易長出單個(gè)菌落；時(shí)間太短，菌落形態(tài)就不理想。因此，在培養(yǎng)時(shí)要特別注意對時(shí)間的把控。

應(yīng)注意保存分離得到的乳酸菌。如果接種在MRS斜面培養(yǎng)基上，則需保存于4 ℃冰箱中。乳酸菌在MRS斜面培養(yǎng)基上可以存活一周左右，所以接種一周后要重新接種保存。也可以使用MRS甘油冷凍保存，至少可保存8個(gè)月以上。

乳酸菌平板劃線時(shí)，應(yīng)盡量劃細(xì)并逐步灼燒以減少含量，這樣比較容易得到單個(gè)菌落。

在雞腸道內(nèi)的多種細(xì)菌中，最具代表性的有益菌是乳酸桿菌[10]。臨床試驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)室研究表明，乳酸菌對腸道內(nèi)的細(xì)菌，如大腸桿菌、沙門氏菌等所引起的腸道感染有較為明顯的拮抗作用[11]。乳酸菌分離后的抑菌試驗(yàn)也對此有所證實(shí)，尤其是對致病性大腸桿菌有一定的抑制作用，可以作為益生素的備用菌株。本研究為開發(fā)應(yīng)用乳酸菌提供了參考依據(jù)和菌種保證。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Isolation and Identification of Lactobacillus in Intestinal Tract of the Chickens and Its Antibacterial Test in Vitro

Liu Ge，Liu Ronghuan，Liu Shenglan，Zhang Peisheng，Yu Huiju，Zhang Qian，Qu Yonggang
（College of Animal Science and Technology，Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003）

In order to obtain Lactobacillus with good antimicrobial activity and strong adaptability in intestinal tract of chickens，the strains were isolated from small intestine of healthy chickens and identifed by biochemical test. As a result，6 strains were successfully isolated. Through Gram staining and biochemical test，it was identifed that these 6 strains were Lactobacillus minor（L.minor），L. johnsonii，L. curvatus，L. intestinalis，L. acidlophilus and L. plantarum. In vitro，the antibacterial tests were conducted，and the results showed that the L. intestinalis had a certain antibacterial activity against E.Coli，which would provide theoretical foundation for the development of probiotics.

chicken；Lactobacillus；isolation and identifcation；antibacterial test in vitro

book=86,ebook=92

S858.31

B

1005-944X（2017）01-0086-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.01.024

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)（2013BA002）

屈勇剛