王鴻康，李 鳴，謝 雋，黃 芹

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，湖北 武漢 430034)

黃柏提取物小檗堿對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生及炎性因子的影響

王鴻康，李 鳴，謝 雋，黃 芹

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院，湖北 武漢 430034)

目的 探討黃柏提取物小檗堿對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生及炎性因子的影響。方法 采用體質(zhì)量350～400 g雄性Wistar大鼠制備頸動(dòng)脈球囊損傷模型，將40只成模大鼠隨機(jī)分為模型組和小檗堿組各20只，其中小檗堿組給予小檗堿2.5 mg/kg腹腔注射，每天1次，連續(xù)14 d。另取20只雄性Wistar大鼠僅行頸部切開作為假手術(shù)組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死各組大鼠并取左側(cè)頸動(dòng)脈，經(jīng)石蠟包埋后進(jìn)行HE染色，觀察病理形態(tài)并比較各組血管內(nèi)膜面積、中膜面積及內(nèi)膜與中膜面積的比值(I/M)，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測各組血清炎癥因子[單核細(xì)胞趨化因子-1(MCP-1)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和前列腺素E2(PGE2)]水平，同時(shí)采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測左側(cè)頸動(dòng)脈標(biāo)本中炎癥反應(yīng)限速酶環(huán)氧化酶-2(COX-2)mRNA和磷脂酶A2mRNA水平。結(jié)果 假手術(shù)組血管無內(nèi)膜增生，且光滑完整；模型組出現(xiàn)嚴(yán)重血管內(nèi)膜增生，且發(fā)生嚴(yán)重管腔狹窄；小檗堿組血管內(nèi)膜增生受抑制，管腔狹窄獲顯著緩解。 模型組新生血管內(nèi)膜面積、I/M及血清MCP-1、CRP、TGF-β、PGE2水平和左側(cè)頸動(dòng)脈COX-2 mRNA和磷脂酶A2mRNA水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；小檗堿組上述指標(biāo)均明顯低于模型組(P均<0.05)，但除CRP與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余指標(biāo)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)。結(jié)論 黃柏提取物小檗堿可抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生及炎性反應(yīng)，可能與其抑制炎癥反應(yīng)限速酶的表達(dá)水平有關(guān)。

黃柏提取物小檗堿；頸動(dòng)脈球囊損傷；內(nèi)膜增生；炎性因子

術(shù)后再狹窄是動(dòng)脈介入術(shù)預(yù)后不良的主要原因，也是亟須解決的醫(yī)學(xué)難題[1]。術(shù)后再狹窄是一個(gè)復(fù)雜的病理過程，主要表現(xiàn)為血管內(nèi)膜增厚及管腔狹窄，其中血管平滑肌過度增殖遷移及細(xì)胞外基質(zhì)大量合成是主要病因，目前研究熱點(diǎn)主要集中在如何預(yù)防術(shù)后內(nèi)膜增生[2-3]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)參與了血管的早期重構(gòu)，而眾多炎性因子也參與了血管重構(gòu)性疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。小檗堿(berberine, Ber)又名黃連素，是從黃柏等植物中提取的異喹啉類生物堿，其最初是作為抗菌藥物在臨床上開始使用[5]，后在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)對(duì)循環(huán)、血糖等有明顯影響，進(jìn)而發(fā)掘出其對(duì)心血管、血糖等方面的藥用功能[6-7]。近年來隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有較強(qiáng)的抗炎作用[8]，但目前鮮有報(bào)道其在血管損傷后內(nèi)膜增生中的作用。故本研究采用大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型，以探討小檗堿對(duì)大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后內(nèi)膜增生及炎性因子的影響。

1 實(shí)驗(yàn)資料

1.1 主要試劑 小檗堿購自美國Sigma公司，單核細(xì)胞趨化因子-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒均購自碧云天生物科技公司，轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)、前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)ELISA檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，TRIzol 試劑購自上海生工生物工程有限公司，TakaRa PrimeScript?RT reagent kit、SYBR?Premix ExTaq kit購自大連寶生物工程有限公司，環(huán)氧化酶-2(COX-2)、磷脂酶A2及內(nèi)參引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷模型的建立 選用北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供的體質(zhì)量350～400 g 雄性Wistar大鼠，麻醉后行頸部正中切口，逐層分離筋膜，鈍性分離左側(cè)頸總動(dòng)脈并阻斷其血流，從頸外動(dòng)脈插入1.5 mm球囊導(dǎo)管(美國Metronic 公司)至左頸總動(dòng)脈內(nèi)，反復(fù)抽拉球囊導(dǎo)致左頸總動(dòng)脈內(nèi)膜損傷。術(shù)后結(jié)扎頸外動(dòng)脈，恢復(fù)血流，縫合切口并肌注青霉素抗感染。

1.3 動(dòng)物分組及干預(yù) 將40只成模大鼠隨機(jī)分為模型組和小檗堿組，每組20只。其中小檗堿組給予小檗堿2.5 mg/kg腹腔注射，每天1次，連續(xù)14 d。另取20只雄性Wistar大鼠僅行頸部切開作為假手術(shù)組。本研究中所用大鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房中，人工控制光照時(shí)間9：00—21：00，明暗交替時(shí)間為12∶12，濕度控制在60%～70%，室溫為(22±1)℃。

1.4 血管病理形態(tài)學(xué)觀察及檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后每組各隨機(jī)取10只處死，取出左側(cè)頸總動(dòng)脈，標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋后常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，從每段血管的橫截面隨機(jī)切下3 張切片后，采用image pro-plus圖像分析軟件分析血管內(nèi)膜面積、中膜面積并計(jì)算內(nèi)膜/中膜( I /M) 面積比。

1.5 血清炎癥因子水平檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后行心室取血3 mL，靜置1 h后離心(3 000 r/min×15 min)，收集上清液，采用ELISA試劑盒檢測血清MCP-1、CRP、TGF-β及PGE2水平，嚴(yán)格遵循試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.6 COX-2 mRNA和磷脂酶A2mRNA水平檢測 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死每組剩余大鼠，取左側(cè)頸動(dòng)脈，采用TRIzol試劑提取總RNA，采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，根據(jù)SYBR?Premix ExTaq Ⅱ kit 說明書在美國ABI Prism 7000 熒光定量PCR 儀上進(jìn)行qRT-PCR，以β-actin為內(nèi)參。采用2-△△Ct法計(jì)算組織中COX-2和磷脂酶A2的mRNA水平。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠血管病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及血管內(nèi)膜增生情況比較 假手術(shù)組血管無內(nèi)膜增生，且光滑完整；模型組出現(xiàn)嚴(yán)重血管內(nèi)膜增生，且發(fā)生嚴(yán)重管腔狹窄；小檗堿組血管內(nèi)膜增生受抑制，管腔狹窄獲顯著緩解。模型組新生血管內(nèi)膜面積及I/M均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)，小檗堿組新生血管內(nèi)膜面積及I/M均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠新生血管內(nèi)膜面積、中膜面積及I/M比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較 模型組大鼠血清MCP-1、CRP、TGF-β及PGE2水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；小檗堿組上述炎癥因子水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，除CRP與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P>0.05)，其余指標(biāo)水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)。見表2。

2.3 各組大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈炎癥反應(yīng)限速酶COX-2和磷脂酶A2的mRNA水平比較 模型組大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈COX-2和磷脂酶A2的mRNA水平均明顯高于假手術(shù)組(P均<0.05)；小檗堿組COX-2和磷脂酶A2的mRNA水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，但仍高于假手術(shù)組(P均<0.05)。見表3。

表2 各組大鼠血清中炎癥因子水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

表3 各組大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈炎癥反應(yīng)限速酶COX-2和磷脂酶A2mRNA水平比較

注：①與假手術(shù)組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

3 討 論

血管重構(gòu)是血管為適應(yīng)內(nèi)外環(huán)境變化而發(fā)生的結(jié)構(gòu)與功能適應(yīng)性改變，根據(jù)結(jié)局分為正性重構(gòu)和負(fù)性重構(gòu)，前者主要為血管通過代償?shù)姆绞綌U(kuò)大以防止管腔內(nèi)徑變小，而后者為由血管代償不足或收縮導(dǎo)致的管腔狹窄[9]。術(shù)后再狹窄是一種負(fù)性血管重構(gòu)，可嚴(yán)重影響動(dòng)脈介入術(shù)的預(yù)后[10]，而炎癥反應(yīng)在此過程中起到重要作用，如血管早期出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞浸潤及炎癥因子水平上升[11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)大量抑制內(nèi)膜增生的策略同時(shí)具有抗炎的效果，且直接抑制炎癥反應(yīng)可有效改善內(nèi)膜增生[12-13]。以上證據(jù)表明抑制炎癥反應(yīng)可能為防治血管損傷后內(nèi)膜增生的可行途徑。

小檗堿作為一種傳統(tǒng)的抗炎藥物，臨床上常用于治療急性腸道炎癥反應(yīng)引起的腹瀉等[8]，此外對(duì)胰島素抵抗和糖代謝異常有較好的治療效果[14]。該藥物目前已廣泛用于臨床，對(duì)防治冠心病經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)后發(fā)生再狹窄有一定價(jià)值，但需要更多臨床證據(jù)的支持。鑒于炎癥反應(yīng)在血管重建中的重要作用，筆者推測小檗堿對(duì)血管損傷后內(nèi)膜增生有抑制效果，故本研究采用常用的頸動(dòng)脈球囊損傷模型來進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重血管內(nèi)膜增生，且發(fā)生嚴(yán)重管腔狹窄，而新生內(nèi)膜面積及I/M均明顯升高，表明模型制備成功，為一種負(fù)性血管重建；給予小檗堿處理后的大鼠新生血管內(nèi)膜面積及I/M均較模型組明顯降低，提示小檗堿可抑制血管內(nèi)膜增生，可能與其改善炎癥反應(yīng)有關(guān)；但小檗堿處理后新生血管內(nèi)膜面積及I/M仍高于假手術(shù)組，可能是由于治療時(shí)間過短或劑量不足造成的，有待延長觀察時(shí)間和提高劑量進(jìn)行研究。

炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致血管內(nèi)膜增生，也是血管重構(gòu)的早期表現(xiàn)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠血清MCP-1、CRP、TGF-β及PGE2水平均明顯高于假手術(shù)組，表明頸動(dòng)脈球囊損傷后發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，而給予小檗堿處理后以上指標(biāo)均顯著降低，直接證實(shí)該藥物可抑制頸動(dòng)脈球囊損傷后的炎癥反應(yīng)。炎癥信號(hào)通路可調(diào)控炎癥反應(yīng)，而其中限速酶為調(diào)控的關(guān)鍵。本研究進(jìn)一步分析了頸總動(dòng)脈中COX-2和磷脂酶A2mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示與炎癥因子的變化趨勢一致，小檗堿可抑制炎癥反應(yīng)中的限速酶表達(dá)，可能為其減輕炎癥反應(yīng)的機(jī)制。

綜上所述，黃柏提取物小檗堿可抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后血管內(nèi)膜增生及炎性反應(yīng)，可能與其抑制炎癥反應(yīng)限速酶的表達(dá)水平有關(guān)。

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Effect of Cortex Phellodendri extract berberine on intimal hyperplasia and inflammatory factors after carotid artery balloon injury in rats

WANG Hongkang, LI Ming, XIE Jun, HUANG Qin

(Puai Hospital Affiliated to Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430034, Hubei, China)

Objective It is to investigate the effect of Cortex Phellodendri extract berberine on intimal hyperplasia and inflammatory factors after carotid artery balloon injury in rats.Methods The carotid artery balloon injury models were prepared with Wistar male rat with body mass 350-400 g, 40 cases of carotid artery balloon injury model rats were randomly divided into model group and berberine group with 20 rats in each group, the animals in the berberine group were given berberine 2.5 mg/kg intraperitoneal injection, once a day, treatment lasted for 14 days.Another 20 male Wistar rats were treated with neck incision as sham operation group.At the end of the experiment, all rats were killed and the left carotid artery were taken out to embedd paraffin and HE staining, the pathological morphology were observed, and the intimal area, medial area, intimal and medial area (I/M) were compared; the levels of serum inflammatory factors [monocyte chemoattractant factor -1 (MCP-1), C-reactive protein (CRP), transforming growth factor beta (TGF-β) and prostaglandin E2(PGE2)] were detected by enzyme-linked immunosorbent assay, and the levels of inflammation reaction rate limiting enzyme cyclooxygenase -2 (COX-2) mRNA and phospholipase A2mRNA in the left common carotid artery specimens were detected by real-time quantitative PCR method.Results In the sham operation group, the vascular intima had non hyperplas, it was smooth and complete; severe vascular intimal hyperplasia were appeared in the model group, and the lumen were stenosed severely; vascular intimal hyperplasia in berberine group was inhibited, the stenosis was relieved.The neointimal area, I/M and serum MCP-1, CRP, TGF-β, PGE2and left carotid artery COX-2 mRNA and phospholipase A2mRNA levels in the model group were significantly higher than those in the sham operation group (allP<0.05); the above indexes in the berberine group were significantly lower than those in the model group (allP<0.05), the other indexes except the CRP were significantly higher than the sham operation group (allP<0.05).Conclusion Cortex Phellodendri extract berberine can inhibit vascular intimal hyperplasia and inflammatory reaction after carotid artery balloon injury of rat, it may be related to the inhibition of inflammatory reaction rate limiting enzyme expression level.

Cortex Phellodendri extract berberine; carotid artery balloon injury; intimal hyperplasia; inflammatory factor

王鴻康，男，主治醫(yī)師，碩士，擅長普外科各類疾病診斷、治療及各種危重復(fù)合傷的急診搶救、手術(shù)等。

武漢市衛(wèi)生計(jì)生委科研項(xiàng)目(WZ15D12)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.36.002

R-332

A

1008-8849(2016)36-3994-03

2016-05-13