李浩詣，汪 云，黃 科

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，重慶 400038)

聯(lián)合用藥靶向膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞的治療進展

李浩詣，汪 云，黃 科

(第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，重慶 400038)

腫瘤干細胞；膠質(zhì)母細胞瘤；聯(lián)合用藥；惡性膠質(zhì)瘤；腫瘤靶向治療

膠質(zhì)母細胞瘤作為常見的惡性膠質(zhì)瘤，其等級系數(shù)高，致死性強。隨著腫瘤干細胞理論的提出，為腫瘤靶向治療提供了新的途徑。通過聯(lián)合用藥抑制生長機制，阻止膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞的增殖，從而為靶向治療惡性膠質(zhì)瘤提供了可能。本文就聯(lián)合用藥靶向膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞進行簡要綜述。

1 介紹

腫瘤的發(fā)生是一群失控的同質(zhì)性的腫瘤細胞所組成，每個腫瘤細胞都具有獨立無限增殖的能力，并且通過轉(zhuǎn)移侵入其他機體組織造成腫瘤細胞的擴散[1]。近年來，由于有些腫瘤細胞與干細胞具有相似的特性包括信號傳導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子、細胞表面受體等，并提出了腫瘤干細胞的假說。該學(xué)說認為，腫瘤的發(fā)生與腫瘤干細胞有關(guān)，為腫瘤靶向治療提供了新的突破點。傳統(tǒng)意義上的腫瘤治療包括手術(shù)切除、化療和放療，針對性并不強，惡性腫瘤的預(yù)后較差，術(shù)后生存率不高，復(fù)發(fā)的可能性也較大[2-4]。并且腫瘤細胞伴有較強的耐藥性機制，對傳統(tǒng)療法并不敏感[5]。因此，聯(lián)合靶向療法為腫瘤治療提供了新的途徑。

2 干細胞與腫瘤干細胞

2.1 干細胞 干細胞具有持續(xù)自我更新并能夠促使同類細胞的成熟以及暫時擴增細胞子代數(shù)量的潛能和相應(yīng)機體細胞的增殖能力。另外，這類干細胞擁有分化潛能，可以分化成體內(nèi)的各類組織，主要負責(zé)組織的再生和修復(fù)[6-8]?？傊?，干細胞是一類高等動物體內(nèi)未充分分化、具有自我更新和多向分化潛能的細胞。

2.2 腫瘤干細胞 在CD34+/CD38-表型的人急性髓性白血病、乳腺癌以及各細胞層次間都發(fā)現(xiàn)了一類具有自我更新、增殖能力，并與腫瘤細胞有相似特性的異質(zhì)性細胞[8-10]。在惡性腫瘤初期的生長發(fā)育中，由一群在形態(tài)和表型方面具有致瘤性潛能的細胞亞群所構(gòu)成[11-15]，在一定程度上具由自我更新、不定向分化潛能[16-17]、異位再生性及高度耐藥性。腫瘤干細胞通過不對稱分裂方式進行增殖，在不同的環(huán)境內(nèi)具有成瘤特性，其細胞膜表面的ABC轉(zhuǎn)運體異常的發(fā)達，抗藥性較強[18]。同樣，腫瘤干細胞是一群具有異質(zhì)性的細胞群體，其細胞膜表面抗原、細胞漿內(nèi)的蛋白、生物效應(yīng)、增殖速率、代謝程度以及系統(tǒng)抗藥性各不相同[8,19-20]。多數(shù)信號級聯(lián)因子和能夠介導(dǎo)正常生理干細胞行為的基質(zhì)原件間相互作用及其正常發(fā)展過程都已被認為在腫瘤生長初期和發(fā)展過程中扮演了不可缺少的角色[21]。目前對于膠質(zhì)瘤干細胞的研究表明，膠質(zhì)瘤干細胞常用的標(biāo)志物是CD133+和CD15+,而CD15+是膠質(zhì)母細胞瘤具有膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞的特征且具有更高的致瘤性[22-24]。根據(jù)目前已達成的共識定論，腫瘤干細胞是一類在腫瘤組織內(nèi)擁有自我更新、不對稱分化并具有致瘤潛能的異質(zhì)性干細胞[25],其結(jié)果是維持腫瘤干細胞數(shù)目穩(wěn)定并產(chǎn)生腫瘤。

2.3 干細胞與腫瘤干細胞的異同 腫瘤干細胞與干細胞之間的相似點：1)干細胞與腫瘤干細胞之間具有相似的表面抗原；2)兩者生長發(fā)育都具有較高的端粒酶活性；3)干細胞與腫瘤干細胞都具有自我更新、無限增殖和不對稱分化的能力；4)具有相似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其代表性的通路包括Wnt、Notch、Sonic Hedgehog、EGFR等通路，這些都是目前認為在干細胞生長發(fā)育及分化中其重要作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑；5)兩者具有多數(shù)相同的轉(zhuǎn)錄因子，包括Sox2、Oct4、Nanog等，對維持干細胞的干性，調(diào)節(jié)干細胞的生長發(fā)育具有重要的意義[26-27]；6)干細胞與腫瘤干細胞有相似的重力密度。但兩者之間依然存在不同的特點：1)腫瘤干細胞通過不對稱分化，增殖產(chǎn)生異質(zhì)性的腫瘤細胞；2)腫瘤干細胞在腫瘤中含量非常低，但其致瘤性強[28-29]；而在機體各個組織中，都存在干細胞，其作用一般是對機體損傷進行一定的修復(fù)作用；3)腫瘤干細胞的細胞膜表面ABCG2異?；钴S，其耐藥機制較強[18]。

2.4 膠質(zhì)母細胞瘤 膠質(zhì)母細胞瘤被WHO組織認定為第4級星形膠質(zhì)瘤，即使通過外科手術(shù)切除，放療和化療的方式來抑制膠質(zhì)母細胞瘤的增殖，然而其治療效果并不明顯[5,30]。早期研究[31-32]證明膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞對傳統(tǒng)化療及放療都有一定的抵抗特性。由于膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞可能與膠質(zhì)母細胞瘤復(fù)發(fā)有一定的內(nèi)在聯(lián)系[33-36]。因此，傳統(tǒng)療法已經(jīng)不能滿足治療的需求。

3 聯(lián)合靶向治療膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞

3.1 阿司匹林聯(lián)合替莫唑胺靶向治療膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞 目前，在臨床膠質(zhì)母細胞瘤治療中，廣泛使用且能夠抑制膠質(zhì)母細胞瘤增殖的藥物是替莫唑胺。替莫唑胺的用藥標(biāo)準(zhǔn)是每周期28 d以內(nèi)，每次持續(xù)用藥5 d，每天使用150～200 mg·m-2[37]。然而惡性膠質(zhì)瘤的多抗藥性較強，替莫唑胺半壽期短，不良反應(yīng)較明顯，對腫瘤的殺傷力較弱，靶向治療并不明顯。在膠質(zhì)瘤樣干細胞中，Wnt、STAT3通路活性較為明顯。因此,Shi等[38]提出利用阿司匹林聯(lián)合替莫唑胺用藥通過抑制Wnt通路治療膠質(zhì)母細胞瘤。有研究[39-40]通過poly誘導(dǎo)合成微球，利用噴霧干燥技術(shù)，將膠質(zhì)母細胞瘤細胞毒性分別注入含有阿司匹林、替莫唑胺以及阿司匹林聯(lián)合替莫唑胺的微球中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：利用阿司匹林微球治療通過抑制Wnt通路的轉(zhuǎn)錄活性，可誘導(dǎo)體外具有活性的Ln229和U87細胞輕微的凋亡，并抑制其輕微的增殖。然而，與替莫唑胺單獨治療膠質(zhì)母細胞瘤相比，阿司匹林與替莫唑胺的聯(lián)合用藥對于膠質(zhì)母細胞瘤的抑制更加明顯。其可誘導(dǎo)Ln229和U87細胞較明顯的凋亡并抑制其增殖，對β-catenin信號、β-catenin/TCF4轉(zhuǎn)錄活性的抑制應(yīng)答、STAT3熒光素酶都具有較強的抑制作用以及下游的靶基因在一定程度上具有下調(diào)的趨勢，在腫瘤干細胞中β-catenin/tcf4轉(zhuǎn)錄活性較高。

3.1.1 阿司匹林與替莫唑胺用藥與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

3.1.1.1 Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 Wnt信號通路在多數(shù)器官組織中具有高度的保守性，對胚胎學(xué)的發(fā)展具有重要的意義，并且在控制細胞自我更新、調(diào)節(jié)干細胞以及腫瘤干細胞的生長發(fā)育中維持相對穩(wěn)定的平衡[41-43]。Wnt信號通路通常被Wnt信號配體激活，Wnt蛋白可與細胞表面Frizzled家族特殊受體及LRP家族相關(guān)的低密度脂蛋白受體復(fù)合物結(jié)合。促使細胞質(zhì)中的松散蛋白聚集至細胞膜下，松散蛋白可誘導(dǎo)GSK-3β發(fā)生磷酸化，使其與Axin脫離，拮抗Axin/GSK-3β復(fù)合物的形成，進而阻斷β-catenin的磷酸化、泛素化降解，使得大量游離的β-catenin在細胞質(zhì)聚集并進入細胞核內(nèi)。在細胞核內(nèi)，β-catenin將會與TCF/LEF家族的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，并啟動激活下游的靶基因[43]。轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白，調(diào)節(jié)細胞的增殖及分化。在阿司匹林與替莫唑胺聯(lián)合用藥的治療中，阿司匹林可抑制Wnt通路中β-catenin/tcf4的轉(zhuǎn)導(dǎo)活性，同時能夠提高替莫唑胺對β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的抑制效應(yīng)。通過測定Ln229和U87細胞，不難發(fā)現(xiàn)，阿司匹林通過抑制β-catenin轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[38]。

3.1.1.2 STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 STAT3在神經(jīng)干細胞、星形膠質(zhì)細胞的生長發(fā)育中具有重要的作用[44]，其依據(jù)腫瘤的基因型，在膠質(zhì)母細胞瘤致瘤和抑瘤方面扮演著重要的角色[45]。在神經(jīng)細胞中，STAT3能夠被睫狀節(jié)神經(jīng)細胞營養(yǎng)因子家族細胞活素受體激活，目的是STAT3能夠激活與絡(luò)氨酸激酶相關(guān)的JAK細胞活素受體。隨后，STAT3被募集到細胞活素受體上，當(dāng)?shù)?05號Tyr殘基被磷酸化后，STAT3被激活[44]。STAT3也可以被具有絡(luò)氨酸激酶活性的生長因子受體直接激活，例如EGFR。在膠質(zhì)母細胞瘤中STAT3的mRNA的水平與患者無進展生存期以及總存活數(shù)有關(guān)[46]。STAT3也可與誘導(dǎo)的一氧化氮合成酶和EGFR相互作用提高膠質(zhì)瘤的形成[47]。在膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞中，STAT3信號通路是非?；钴S的，其能夠保持細胞的存活，增殖能力以及多功能干性，并對膠質(zhì)母細胞瘤的生長有著重要的作用[48-50]。在膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞中通過誘導(dǎo)G1期阻滯并造成Cyclin D1下調(diào)和p21WAF1/CIP1上調(diào)來抑制STAT3通路，從而調(diào)節(jié)細胞周期。STAT3的抑制也可造成在膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞中CD133+和c-Myc表達下調(diào)，并造成細胞凋亡[51]。

3.1.2 阿司匹林與替莫唑胺聯(lián)合用藥對腫瘤干細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 惡性膠質(zhì)瘤的表型源于與細胞生長發(fā)育調(diào)節(jié)通路有內(nèi)在關(guān)系的多能機制障礙[52]，其中對膠質(zhì)瘤干細胞生長最具影響的通路之一是Wnt/β-catenin信號通路，其通過β-catenin/TCF4轉(zhuǎn)錄復(fù)合體激活并作為下游相關(guān)效應(yīng)物激活的中心信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括AKT1[53]、AKT2[54]、和STAT3[55]。β-catenin的過度表達，不僅能維持惡性膠質(zhì)瘤細胞的表型，也能通過抑制惡性膠質(zhì)細胞的凋亡從而提高細胞的活性并提升細胞的多抗藥性能力[56-57]。

阿司匹林不僅對β-catenin信號有較明顯的抑制，而且也是作為臨床上廣泛使用的抗炎類藥物。服用阿司匹林能夠減少某些長期腺癌的發(fā)病率，并且在藥理學(xué)方面能證明，阿司匹林對腫瘤細胞遠端轉(zhuǎn)移有一定的阻礙作用[58]。因此選用阿司匹林治療惡性膠質(zhì)瘤，目的是為了提高替莫唑胺的藥效，對β-catenin通路的靶向抑制，從而提高惡性膠質(zhì)瘤的治療效果。

通過研究膠質(zhì)瘤干細胞的表型發(fā)現(xiàn)，AKT信號的過度表達，能抵抗替莫唑胺的藥性[59-60]，在膠質(zhì)母細胞瘤和惡性黑素瘤中，敲除PI3K/AKT信號因子能夠提高替莫唑胺的治療效果[61-62]。STAT3在膠質(zhì)母細胞瘤中存在一定程度的表達，其是致瘤的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠提高惡性膠質(zhì)瘤細胞的增殖和侵入力，亦能提高血管的再生能力，為惡性腫瘤的生長提供豐富的血供[63]。Bcl-2是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關(guān)鍵因子，其表達與惡性腫瘤的發(fā)展與多抗藥性有關(guān)[64]， AKT與STAT3的表達下調(diào)，同樣可抑制Bcl-2的表達[57,65]。因此通過阿司匹林和替莫唑胺微球?qū)嶒灪?，發(fā)現(xiàn)AKT的表達在Ln229和U87膠質(zhì)細胞中表達都有下調(diào)，STAT3對替莫唑胺烷基化能力下降，說明STAT3在一定程度上減少。阿司匹林和替莫唑胺微球?qū)嶒炞C明，通過敲除β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而介導(dǎo)減少Bcl-2的表達、降低膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞的多抗藥性、抑制其增殖并促進凋亡，提高替莫唑胺的治療效果。

3.2 Anti- galectin-1 siRNA與Anti-EGFR siRNA聯(lián)合降低膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞對替莫唑胺的抗藥性 EGFR在腫瘤的發(fā)展中起到了關(guān)鍵的因素，能夠提高腫瘤干細胞的生長及對藥物的抗性，galectin-1是一種細胞表面的糖蛋白，在肝腫瘤干細胞中的表達可能較活躍[66-67]。因此，Danhier等[68]提出利用Anti-galectin-1 siRNA和Anti-EGFR siRNA聯(lián)合，以殼聚糖接枝脂質(zhì)納米膠囊為載體，通過CED方式將藥物注入到小鼠體內(nèi)以及U87細胞培養(yǎng)基中，再將替莫唑胺注入，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腫瘤生長明顯被抑制，從腫瘤干細胞學(xué)說角度說明，此聯(lián)合用藥對腫瘤干細胞的增殖起到了明顯的抑制。

3.2.1 siRNA與殼聚糖接枝脂質(zhì)納米膠囊靶向腫瘤干細胞的特點 siRNA是由21～23個核苷酸組成的雙鏈RNA，其能夠激發(fā)與之互補的目標(biāo)mRNA的沉默。單獨使用siRNA治療是有幾個不利的條件：1)siRNA帶負電荷，無法穿過細胞膜與胞漿內(nèi)的靶分子結(jié)合[69-71]；2)siRNA被注入到血液中后，呈現(xiàn)在血液和細胞漿中的核酸酶會使siRNA快速變性失活；3)血液中的免疫作用可能也會使siRNA變性失活[72]。殼聚糖接枝脂質(zhì)納米膠囊作為EGFR抗體和galectin-1抗體siRNA的載體，其有利條件：1)移接的幾丁聚糖具有正電性；2)無毒性并具有生物學(xué)適應(yīng)性[73]。目前，siRNA治療成為現(xiàn)今醫(yī)學(xué)抑制腫瘤增殖的熱點，利用siRNA靶向治療腫瘤干細胞，干擾其細胞漿內(nèi)具有分裂，增殖表達的mRNA,從而達到對腫瘤治療的目的。

3.2.2 Anti-galectin-1 siRNA與Anti-EGFR siRNA聯(lián)合替莫唑胺治療膠質(zhì)母細胞瘤 在腫瘤細胞中，過表達的EGFR和galectin-1能夠?qū)е聦μ婺虬访黠@的抗藥性[74]。在40%～70%的腫瘤患者中，腫瘤細胞內(nèi)的EGFR都存在過表達和較活躍的特性。這說明特異性的突變EGFR形成和表達將提高腫瘤的增殖能力[75-76]。同樣，EGFR在膠質(zhì)瘤干細胞中也起到了關(guān)鍵性的因素，其在膠質(zhì)瘤干細胞中的mRNA分子水平較高[75]。利用siRNA治療后，將腫瘤中EGFR和galactin-1敲除,我們發(fā)現(xiàn)，siRNA的活性效應(yīng)持續(xù)近1周，這說明了siRNA活性的短暫特性[66]。因此，依據(jù)腫瘤是否被治療，腫瘤細胞內(nèi)的組成成分不盡相同[77]。

利用Anti-galactin-1 siRNA與Anti-EGFR siRNA聯(lián)合治療膠質(zhì)母細胞瘤，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細胞瘤的增殖抑制較明顯，通過上述研究得知，膠質(zhì)母細胞瘤細胞中g(shù)alactin-1與EGFR的mRNA表達水平明顯降低[68]?？傊?，Anti-galectin-1 siRNA與Anti-EGFR siRNA聯(lián)合能夠降低膠質(zhì)瘤干細胞對替莫唑胺的抗藥性，從而達到抑制膠質(zhì)母細胞瘤增殖的目的。

4 聯(lián)合用藥靶向膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞的治療意義

聯(lián)合用藥治療膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞是當(dāng)今的腫瘤醫(yī)學(xué)熱點。Zhao等[78]通過鹽酸厄洛替尼與紫草醌聯(lián)合降低EGFR的磷酸化，從而有可能降低膠質(zhì)母細胞瘤對鹽酸厄洛替尼的抗藥性，達到治療膠質(zhì)母細胞瘤的療效。EGFR在腫瘤干細胞中表達較高，很可能是降低腫瘤干細胞表面的EGFR，來抑制腫瘤干細胞的增殖,導(dǎo)致腫瘤生長停滯。聯(lián)合用藥靶向治療惡性腫瘤的意義：1)從根源上抑制腫瘤的增殖;2)對腫瘤干細胞細胞表面的標(biāo)志物靶向性更強;3)通過聯(lián)合用藥能夠增加腫瘤干細胞及腫瘤細胞表面的通透性，降低其抗藥能力，利于藥物的吸收;4)聯(lián)合用藥能夠提高藥物的藥效特性，對惡性膠質(zhì)瘤干細胞的殺傷力更強。目前，聯(lián)合用藥治療針對膠質(zhì)母細胞瘤樣干細胞治療依然處于基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中，尚未在臨床中施行。

5 問題與展望

隨著目前腫瘤干細胞學(xué)說的興起，對于膠質(zhì)母細胞瘤的治療也不僅局限于單一的藥物。雖然如此，但仍有許多關(guān)鍵問題尚未解決，如聯(lián)合用藥是否對血腦屏障起到一定的損傷作用，對機體的毒副反應(yīng)是否更強，以及靶點是否有效等問題，目前還尚未研究清楚，因此，聯(lián)合用藥治療腫瘤干細胞可以說打破了傳統(tǒng)的治療方式，但是更多的機制需要進一步的研究才有可能從根本上找到治療腫瘤的方法。

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李浩詣(1995-)，男，學(xué)士在讀，參與膠質(zhì)瘤干細胞增殖分化相關(guān)研究。E-mail:627269051@qq.com

汪云(1980-)，女，博士，講師，主要從事膠質(zhì)瘤干細胞增殖分化相關(guān)研究。E-mail：yunwang30@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5412.2017.01.029

R739.4；R730.54

A

1673-5412(2017)01-0088-06

2015-07-23)