江漢民++文正華++劉莉莉++單曉政++孫德嶺

摘 要：以青花菜新品種‘津青一號(hào)及其親本為試驗(yàn)材料，用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定雜交種種子純度，從50對(duì)SSR引物中，篩選出了1對(duì)在雜交種和父、母本之間存在顯著差異的引物（L21），該引物擴(kuò)增片段電泳條帶清晰可辨，且雜交種含有父、母本的特異互補(bǔ)帶型。利用該引物對(duì)108株‘津青一號(hào)雜交種進(jìn)行純度鑒定，結(jié)果為96.30%，與大田形態(tài)鑒定結(jié)果98.15%相比，SSR標(biāo)記與大田種植鑒定結(jié)果基本一致。這表明，引物L(fēng)21可用于‘津青一號(hào)的純度鑒定。

關(guān)鍵詞：青花菜；SSR；種子純度鑒定

中圖分類號(hào)：S635.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.

Hybrid Purity Identification of Broccoli Variety ‘Jinqing No.1 Using SSR Method

JIANG Hanmin， WEN Zhenghua， LIU Lili， SHAN Xiaozheng， SUN Deling

（Key Laboratory of Vegetable Germplasm Resources Innovation，Tianjin Kernel Vegetable Research Institute，Tianjin 300384，China）

Abstract： In this paper， broccoli hybrids， 'Jinqing No.1' and its parents were used as plant materials，SSR molecular marker was used to analysis the polymorphism of these materials. Among the 50 pairs of SSR primers screened，one pair of primers（L21） had significant and legible differences between hybrid seeds and their parents. 108 individual seeds were tested with the primer， and the seed purity was 96.30%， which was closed to the result identified in the field of 98.15%.The results indicated SSR primer L21 could be used to detect the purity of 'Jinqing No.1'.

Key words： Broccoli； SSR； seed purity identification

青花菜（Brassica oleracea L.var.italica），又名西蘭花、青花椰菜等，屬于十字花科蕓薹屬1、2年生草本植物。青花菜以主莖及側(cè)枝頂端形成的綠色花球?yàn)槭秤貌课?，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，無(wú)論色澤、口感都備受青睞，深受廣大群眾所喜愛(ài)。

在青花菜的種植生產(chǎn)中，青花菜雜交種子的純度在很大程度上影響了品質(zhì)和產(chǎn)量。在種子生產(chǎn)中，由于一些不可避免的因素混入自交產(chǎn)生的F1代種子或劣質(zhì)種子及一些其他品種的雜交后代，從而導(dǎo)致生產(chǎn)出的種子純度不高。在種子市場(chǎng)上，不法商販銷售的假冒種子在很大程度上也降低了種子的質(zhì)量。保證雜交種子的純度及優(yōu)良品質(zhì)，成為確保青花菜市場(chǎng)供應(yīng)優(yōu)質(zhì)青花菜的一個(gè)重要前提。鑒定種子純度的傳統(tǒng)方法是大田形態(tài)學(xué)鑒定，該方法在鑒定周期和鑒定費(fèi)用上有其局限性，且形態(tài)觀察的準(zhǔn)確度難以保證。分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)使種子在分子水平上的鑒定成為可能。分子標(biāo)記技術(shù)在種子鑒定方面的應(yīng)用，節(jié)省了鑒定的時(shí)間和成本。SSR是DNA分子標(biāo)記中的一種，是以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，多態(tài)性高，成本較低，標(biāo)記呈顯性和共顯性，操作較易實(shí)現(xiàn)，重復(fù)性較好[1]。有研究報(bào)道，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)能準(zhǔn)確鑒定青花菜種子的純合度[2]。此外，SSR分子標(biāo)記也已經(jīng)應(yīng)用到其他經(jīng)濟(jì)作物種子純度的鑒定，包括水稻、油菜、大豆、玉米等[3-10]。

本研究以津青一號(hào)及其父、母本為研究材料，利用SSR分子標(biāo)記進(jìn)行篩選，以期得到能產(chǎn)生特殊標(biāo)記的引物，在檢驗(yàn)該引物可靠后將其運(yùn)用到雜交種子的鑒定中，供雜交種子在分子水平鑒定借鑒。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為11DR-100（父本）、10FS-2（母本）、津青一號(hào)（F1代）。

1.2 SSR鑒定種子純度的評(píng)價(jià)

1.2.1 全基因組DNA提取 以改良CTAB法提取全基因組DNA，獲得的全基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)純度并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR引物 根據(jù)GenBank（http： / /www.ncbi.nlm.nih.gov /sites /entrez）網(wǎng)站上公布的青花菜EST序列設(shè)計(jì)合成SSR引物，選取長(zhǎng)度大于100 bp的EST序列，共合成SSR引物50對(duì)。

1.2.3 標(biāo)記篩選 以11DR-100、10FS-2及津青一號(hào)的全基因組DNA為模板，對(duì)50對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，篩選出可在雜交F1代中擴(kuò)增出與父母本互補(bǔ)帶型的引物。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃，5 min； 94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，45 s；20 cycles；72 ℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用3%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行篩選。

1.2.4 分子標(biāo)記篩選的評(píng)價(jià) 在種有津青一號(hào)的試驗(yàn)田內(nèi)進(jìn)行隨機(jī)抽樣，隨機(jī)選取12個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域隨機(jī)選取9株，通過(guò)大田形態(tài)學(xué)方法對(duì)抽取的植株進(jìn)行純度鑒定，并用已篩選到的SSR分子標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)得到的結(jié)果與試驗(yàn)田種植結(jié)果進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)所篩選出的分子標(biāo)記的可用性。種子純度=（1-非雜交F1個(gè)體總數(shù)/鑒定的個(gè)體總數(shù)）×100%[11]。

1.3 種子純度的鑒定

隨機(jī)選取種子300粒進(jìn)行鑒定。以種子長(zhǎng)出的真葉為材料進(jìn)行DNA提取，具體方法為：將濾紙浸濕后放入培養(yǎng)皿中，將種子放于濾紙上，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中注意保濕，待長(zhǎng)出真葉后用于全基因組DNA提取，方法同1.2.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組DNA提取結(jié)果

11DR-100、10FS-2、‘津青一號(hào)的全基因組DNA提取結(jié)果如圖1。結(jié)果顯示，DNA主條帶較單一，沒(méi)有明顯的降解現(xiàn)象，表明本試驗(yàn)用的改良CTAB提取法能獲得高質(zhì)量的全基因組DNA，獲取的DNA可用于后續(xù)的SSR分子標(biāo)記的篩選。

2.2 標(biāo)記篩選結(jié)果

50對(duì)SSR引物擴(kuò)增11DR-100、10FS-2、津青一號(hào)，對(duì)雙親及F1代進(jìn)行特異分子標(biāo)記分析，篩選可用的SSR標(biāo)記。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，有43對(duì)引物可擴(kuò)增出有效條帶，并從中篩選出1對(duì)可用于鑒定的引物L(fēng)21（F：5′-GGATTTTCAAGACTCTTCGGG-3′，R：5′-TGCCAAGTTCGTAGTCTTGC-3′）。該引物可在親本中擴(kuò)增出單一互補(bǔ)的條帶，在雙親和F1代中共顯性分離，兩條特異條帶的大小為200，170 bp，結(jié)果見(jiàn)圖2。該引物可用來(lái)鑒定雜交種質(zhì)資源的純度。

2.3 利用SSR鑒定青花菜雜交種純度的評(píng)價(jià)

在試驗(yàn)田中，對(duì)隨機(jī)選取的108株青花菜的莖、花球、葉片進(jìn)行調(diào)查分析和形態(tài)學(xué)鑒定。鑒定結(jié)果表明，108株青花菜中有2株青花菜的莖、葉片、花球與母本的表現(xiàn)型不一致，通過(guò)田間形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果表明，‘津青一號(hào)種子純度為98.15%。對(duì)隨機(jī)選取的108株植株用已篩選出的SSR引物擴(kuò)增進(jìn)行鑒定分析。發(fā)現(xiàn)：其中有4株為混雜品種，經(jīng)鑒定津青一號(hào)種子的純度為96.30%，引物擴(kuò)增的部分結(jié)果見(jiàn)圖3。

2.4 對(duì)雜交種子的檢驗(yàn)

利用篩選得到的SSR引物對(duì)隨機(jī)選取的300?！蚯嘁惶?hào)商品種子進(jìn)行純度檢測(cè)，PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，引物在其中295粒中均表現(xiàn)出共顯性分離，有5粒為混雜種子，純度為98.33%，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論與討論

3.1 SSR引物

合成的50對(duì)引物是根據(jù)GenBank網(wǎng)站上公布的青花菜EST序列設(shè)計(jì)的，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，有43對(duì)SSR引物在青花菜中可擴(kuò)增出有效條帶。SSR分子標(biāo)記是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的，條帶相對(duì)單一、穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單，成本較低。篩選出可用于鑒定雜交F1代的SSR分子標(biāo)記，較形態(tài)學(xué)鑒定能有效減少鑒定的周期和成本，能快速準(zhǔn)確地鑒定雜交F1代種子的純度。

3.2 SSR分子標(biāo)記鑒定種子純度

雜交種子的純度在很大程度上影響了青花菜的品質(zhì)和產(chǎn)量，在種子生產(chǎn)中由于一些不可避免的因素影響，造成了個(gè)別品種種子的混雜，使得種子的純度受到影響。種子鑒定的傳統(tǒng)方法即大田形態(tài)觀察法的周期長(zhǎng)，形態(tài)區(qū)分的難度較大，易造成種子鑒定的準(zhǔn)確度有偏差。分子標(biāo)記的出現(xiàn)使得種子純度的鑒定周期縮短，穩(wěn)定性提高，準(zhǔn)確度得到保證。王立新等[12]利用SSR、EST-SSR和AFLP-SCAR對(duì)400個(gè)小麥品種進(jìn)行鑒定研究，推薦了7對(duì)SSR引物、5對(duì)EST-SSR引物和3對(duì)AFLP-SCAR引物為檢測(cè)種子純度的核心引物；林琿等[13]應(yīng)用RAPD標(biāo)記對(duì)苦瓜種子進(jìn)行純度鑒定，篩選出1個(gè)引物S115；王全等[14]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)黃瓜種子進(jìn)行純度鑒定，篩選出1對(duì)可用的SSR引物。本研究以11DR-100、10FS-2、津青一號(hào)為材料，用50對(duì)SSR引物對(duì)其擴(kuò)增。在有效的43對(duì)引物中，經(jīng)過(guò)篩選得到1對(duì)在F1代中能產(chǎn)生與親本互補(bǔ)帶型的引物L(fēng)21。在大田中隨機(jī)抽取108個(gè)津青一號(hào)樣品，對(duì)這些樣品分別進(jìn)行大田形態(tài)學(xué)鑒定和SSR分子標(biāo)記鑒定。對(duì)108株青花菜的莖、花球、葉片進(jìn)行調(diào)查分析和形態(tài)學(xué)鑒定，結(jié)果表明津青一號(hào)種子純度為98.15%；利用篩選出的SSR引物L(fēng)21對(duì)108個(gè)‘津青一號(hào)樣品進(jìn)行鑒定分析，結(jié)果表明F1代‘津青一號(hào)種子的純度為96.30%：說(shuō)明SSR分子標(biāo)記篩選方法更能準(zhǔn)確鑒別‘津青一號(hào)種子的純度。

在大田形態(tài)法鑒定的過(guò)程中，受局部生長(zhǎng)環(huán)境不同、光照不均的影響，使青花菜不同品種間的形態(tài)差異不顯著，所以會(huì)造成一些不純品種未被鑒定出來(lái)；而SSR分子標(biāo)記篩選能避免外界因素的影響，在DNA水平上對(duì)青花菜種子的純度進(jìn)行評(píng)價(jià)，不但縮短了鑒定周期且提高了準(zhǔn)確度。

利用SSR分子標(biāo)記鑒定種子純度的方法也可應(yīng)用于其他經(jīng)濟(jì)作物，如甜瓜、水稻、小麥等[15-17]。分子標(biāo)記的應(yīng)用節(jié)省了種子鑒定的經(jīng)費(fèi)和時(shí)間，分子標(biāo)記在種子鑒定方面有應(yīng)用的價(jià)值。

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