張 翅潘德林朱雅寧郝 莉

［1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137］

·實驗報告·

附子中6種生物堿質(zhì)譜裂解機制及醇解產(chǎn)物研究*

張 翅1，2△潘德林1，2朱雅寧1，2郝 莉1

［1.華潤三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137］

目的探討附子中6種生物堿裂解規(guī)律，研究雙酯型生物堿乙醇解產(chǎn)物。方法 采用HPLC-ESI-MS技術(shù)，在正離子模式下，掃描分析雙酯型生物堿在乙醇的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，并闡述其規(guī)律。結(jié)果通過對已知6種生物堿的多級質(zhì)譜分析及文獻調(diào)研，總結(jié)了6種酯型生物堿的裂解規(guī)律，并確定了雙酯型生物堿的乙醇產(chǎn)物。結(jié)論3種雙酯型生物堿在乙醇中，發(fā)生乙醇解反應(yīng)，分別生成8-乙氧基新烏頭堿、8-乙氧基烏頭堿和8-乙氧基次烏頭堿；由于反應(yīng)在加熱條件下進行，還有焦烏頭堿的產(chǎn)生。

附子 烏頭堿 雙酯型生物堿 裂解規(guī)律 醇解產(chǎn)物

附子為毛茛科植物烏頭 （Aconitum carmichaeli Debx.）子根的加工品，是臨床常用的中藥材，具有回陽救逆、補火助陽、散寒止痛等功效［1］，被譽為“回陽救逆第一品”。其主要化學(xué)成分烏頭堿類生物堿，既是發(fā)揮藥效的主要有效成分，又是烏頭、附子中的主要有毒成分［2-3］。該類成分中的雙酯型生物堿毒性最大，對熱不穩(wěn)定，容易發(fā)生水解和乙醇解反應(yīng)。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥成分研究中已經(jīng)廣泛應(yīng)用［4-5］，該技術(shù)與電噴霧電離技術(shù)聯(lián)合（HPLC-ESI-MS）用于樣品的快速分析及鑒定，具有靈敏度高、特異性強、快速、操作簡單等優(yōu)勢。已經(jīng)有文獻利用該技術(shù)對附子中生物堿的水解反應(yīng)開展研究，分析了烏頭堿水解產(chǎn)物及其裂解產(chǎn)物、裂解規(guī)律［6-8］。本文對其醇解反應(yīng)開展研究，通過HPLC-ESI-MS獲得質(zhì)譜數(shù)據(jù)并進行分析，推斷出6種生物堿的質(zhì)譜裂解行為，闡述了雙酯型生物堿醇解轉(zhuǎn)化規(guī)律，為含附子藥品的質(zhì)量分析及安全性評價提供依據(jù)，有利于附子相關(guān)藥品的安全合理應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE-240電子天平（METTLER），Agilent1260高效液相色譜儀，Thermo LCQ-FLEET質(zhì)譜儀，UPT-1-40L優(yōu)普超純水器，AS20500超聲儀（SCIENCE）。

1.2 試藥 新烏頭原堿（批號：110799-201307，中國食品藥品檢定研究院）；烏頭原堿 （批號：110720-200410，中國食品藥品檢定研究院）；次烏頭堿（批號：110798-201307，中國食品藥品檢定研究院）；苯甲酰新烏頭堿（批號：111795-201102，中國食品藥品檢定研究院）；苯甲酰烏頭堿（批號：111794-201303，中國食品藥品檢定研究院）；苯甲酰次烏頭堿 （批號：111796-201303，中國食品藥品檢定研究院）；乙腈（色譜純，Merck）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.3 色譜條件 Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250mm，5 μm），流動相40 mmol/L乙酸銨緩沖液（用氨水調(diào)pH=9.9，A）；乙腈（B），梯度洗脫0~10 min，72%A；10~15 min，72%~67%A；15~45 min，67%~50% A；45~60 min，50%A；流速1 mL/min，柱溫25℃；檢測波長235 nm。

1.4 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，正離子模式檢測；霧化器壓強340 kPa；質(zhì)量掃描范圍：m/z 100~1500；干燥氣體溫度320℃，干燥氣體（N2）流量5 L/min，碰撞氣體為Ar。

1.5 供試品溶液的制備 分別精密稱取對照品苯甲酰新烏頭堿2.24 mg，苯甲酰次烏頭堿2.51 mg，苯甲酰烏頭原堿2.68 mg，新烏頭堿1.31 mg，次烏頭堿1.73 mg，烏頭堿1.46 mg，用無水乙醇定容至100 mL（校正體積為99.4809 mL）容量瓶，得到對照品質(zhì)量濃度分別為：苯甲酰新烏頭堿22.5169 μg/mL，苯甲酰次烏頭堿25.2310 μg/mL，苯甲酰烏頭原堿26.9398 μg/mL，新烏頭堿13.1684 μg/mL，次烏頭堿17.3903 μg/mL，烏頭堿14.6762 μg/mL的混合對照品。量取供試品溶液50 mL至圓底燒瓶中，加熱回流60 min，冷卻后，即得。檢測方法按照1.3和1.4條件進行檢測。

2 結(jié) 果

2.1 混標對照品乙醇解前后色譜圖比較 見圖1和圖2。6種生物堿基本可以達到分離，并且在ESI正離子模式下均可產(chǎn)生［M+H］+。根據(jù)對照品的保留時間和分子量，確定圖2中1、2、3、4、5和6號峰分別為苯甲酰新烏頭堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿。通過醇解前后液相色譜圖比較可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過醇解后新增加了圖2中的7、8、9、10和11共5個色譜峰。其混標溶液總離子流圖見圖3。

圖1 混合對品乙醇解前HPLC色譜圖

2.2 已知生物堿裂解規(guī)律分析 6種酯型生物堿結(jié)構(gòu)圖見圖4，在ESI正離子模式下，烏頭類生物堿最常見的丟失碎片離子是CH3COOH、CH3OH、H2O等，通過研究各個對照品的多級質(zhì)譜可以發(fā)現(xiàn)有如下特征離子：［M+H-32］+，［M+H-50］+，［M+H-60］+，［M+H-60-32-28］+，推斷規(guī)律如下：

圖2 混合對品乙醇解后HPLC色譜圖

圖3 混標溶液總離子流圖

圖4 6種酯型生物堿結(jié)構(gòu)圖

離子［M+H-32］+：在烏頭類生物堿中，碎片32主要來源于甲氧基結(jié)構(gòu)，這6種已知的生物堿結(jié)構(gòu)存在4個甲氧基，根據(jù)文獻采用量子化學(xué)計算結(jié)構(gòu)認為丟失的順序為C-16位、C-11位、然后是C-6位［9］。

離子［M+H-60］+：通過對比雙酯型生物堿和單酯型生物堿中MS2，發(fā)現(xiàn)雙酯型生物堿烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿存在［M+H-60］+，而單酯型生物堿并沒有發(fā)現(xiàn)此碎片離子峰，推測離子［M+H-60］+來源于雙酯型生物堿8位上的側(cè)鏈CH3COO和15位上的H組成，即為脫去一分子CH3COOH產(chǎn)物［10］，見圖6。

圖5 6種生物堿的質(zhì)譜圖

離子［M+H-60-32-28］+：對比雙酯型生物堿和單酯型生物堿的碎片離子峰可以發(fā)現(xiàn)，雙酯型生物堿的質(zhì)譜圖中均有碎片離子［M+H-60-32-28］+出現(xiàn)，碎片28一般是由CH2=CH2或者CO裂解產(chǎn)生，而只有烏頭堿上有乙基取代，所以碎片28只可能來源于CO［11］，見圖6。

圖6 雙酯型生物堿裂解碎片離子結(jié)構(gòu)

離子［M+H-50］+：從對照品二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)離子［M+H-50］+存在于苯甲酰新烏頭堿和苯甲酰烏頭原堿中，而苯甲酰次烏頭堿不存在此離子峰，見圖5。根據(jù)結(jié)構(gòu)可以初步判斷，碎片50的產(chǎn)生主要是脫去一分子水和一分子甲醇產(chǎn)生的。對比三種單酯型生物堿的結(jié)構(gòu)，C-15和C-8上均有羥基，而C-3位上只有苯甲酰次烏頭堿沒有羥基，可以初步判斷離子［M+H-50］+中一分子水主要來自C-3位脫去一分子水［12］，見圖7和圖8。

圖7苯甲酰新烏頭堿和苯甲酰烏頭堿裂解碎片離子結(jié)構(gòu)

在這6種已知的生物堿質(zhì)譜中，沒有出現(xiàn)丟失苯甲酸的離子，即［M+H-122］+；因為如果丟失苯甲酸離子，會在9位和14位之間形成雙鍵，而雙鍵所連接的4個原子不在同一平面，這導(dǎo)致雙鍵的扭曲張力太強而無法形成。所以在二級或三級質(zhì)譜中沒有苯甲酸離子信號。

圖8 苯甲酰次烏頭堿裂解碎片離子結(jié)構(gòu)

2.3 醇解產(chǎn)物定性 8號峰MS圖顯示相對分子量為618（見圖9），與新烏頭堿相對分子量相比減少了14；MS2圖顯示，存在［M+H-50］+，不存在［M+H-60］+和［M+H-60-28］+離子，說明不存在乙?；?，因此7號峰不是去甲基產(chǎn)物，判斷為8位沒有乙酰氧基存在；MS3圖顯示，碎片離子顯示有［M+H-50-46］+出現(xiàn)，應(yīng)為C8位脫去1分子乙醇的產(chǎn)物。根據(jù)已知新烏頭堿和苯甲酰新烏頭堿裂解規(guī)律以及文獻查閱［13］，鑒定7號峰應(yīng)為8-乙氧基新烏頭堿。

圖9 8號峰、9號峰和11號峰的質(zhì)譜圖

9號峰的分子量為632，11號峰的分子量為602，同樣的推理方法得出9號峰和11號峰分別為8-乙氧基烏頭堿和8-乙氧基次烏頭堿（見圖10、圖11）；乙醇解反應(yīng)式見圖12。

圖10 8-乙氧基新烏頭堿和8-乙氧基烏頭堿裂解碎片離子結(jié)構(gòu)

圖11 8-乙氧基次烏頭堿裂解碎片離子結(jié)構(gòu)

圖12 雙酯型生物堿乙醇解反應(yīng)

2.4 其他產(chǎn)物定性 7號峰從MS1可知（圖13），分子量為556；從MS2圖上可以看出，不存在碎片離子峰［M+H-60］+，說明不存在8-位乙?；?；存在碎片離子［M+H-32-28］+，說明存在CO基團。經(jīng)查閱文獻，比對碎片離子峰，確定為焦烏頭堿，是由烏頭堿加熱轉(zhuǎn)化生成［14］。

3 討 論

烏頭堿類生物堿中烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿等雙酯型生物堿毒性最強，致死量極小。臨床應(yīng)用時常需先煎久煎以減弱其毒性，其減毒機制是破壞C8位所連接的酯鍵，由烏頭堿等雙酯型生物堿水解生成苯甲酰烏頭堿等單酯型生物堿，達到減毒增效的目的。目前已有較多文獻對附子中烏頭堿質(zhì)譜裂解行為和雙酯型生物堿的C8位所連接的酯鍵分解反應(yīng)開展研究。陳玉娟等采用ESI-MS正離子模式掃描分析烏頭堿的多級質(zhì)譜碎片，分析了烏頭堿的質(zhì)譜裂解行為［10］；李錚等也采用ESI-MS正離子模式對烏頭堿、中烏頭堿和次烏頭堿的水解產(chǎn)物進行多級質(zhì)譜檢測［15］；王峰峰等利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，分別對烏頭堿、次烏頭堿和新烏頭堿在水中和乙醇中的高溫分解產(chǎn)物進行定性分析［11］。這些研究闡明了部分烏頭堿的裂解規(guī)律，但都是對單一生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律、水解及醇解產(chǎn)物的研究。由于生物堿之間存在相互作用，系統(tǒng)地對附子中6種生物堿質(zhì)譜裂解規(guī)律開展研究，并對破壞雙酯型生物堿C8位酯鍵的方法開展研究，仍然有很重要的意義。

圖13 7號峰質(zhì)譜圖

本文系統(tǒng)地研究了附子中6種酯型生物堿質(zhì)譜裂解機制，為附子藥材、含附子的藥品以及含有該類生物堿的生物樣品快速定性、定量鑒別提供了依據(jù)，為類似化合物結(jié)構(gòu)的鑒定和預(yù)測提供了參考。對于含有此6種生物堿的藥材及制劑，本研究為其質(zhì)量標準制定提供了參考，有利于其臨床安全合理應(yīng)用。

附子作為毒性藥材，對其進行減毒增效一直是研究熱點。傳統(tǒng)中藥材多采用水液煎熬，現(xiàn)代制藥工藝中對部分中藥材采用醇液提取，取得較好的效果。本文分析了雙酯型生物堿乙醇解產(chǎn)物，并總結(jié)了其裂解規(guī)律。新烏頭堿、烏頭堿和次烏頭堿3種雙酯型生物堿在乙醇中發(fā)生乙醇解反應(yīng)，分別生成8-乙氧基新烏頭堿、8-乙氧基烏頭堿和8-乙氧基次烏頭堿。這些研究探索了一種破壞雙酯型生物堿C8位所連接酯鍵的方法，為附子的減毒增效提供了一種新思路，也為后續(xù)研究乙醇解物質(zhì)的毒性和藥效奠定基礎(chǔ)，同時為該類生物堿對照品溶液的配置不能選擇水和乙醇溶劑提供了理論支撐。

本文是對六種生物堿對照品的混合物開展研究，沒有加入其他干擾成分，沒有分析藥材中其他成分對反應(yīng)的交叉影響。結(jié)合藥材成分、生產(chǎn)工藝做進一步的乙醇解反應(yīng)研究，是作者正在開展的工作。

［1］ 國家藥典委員會．中華人民共和國藥典［M］．一部．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：177-178．

［2］ 肖日平，賴小平，趙亞，等．附子6種生物堿在比格犬體內(nèi)藥動學(xué)研究［J］．中草藥，2014，37（2）：284．

［3］ 黃志芳，易進海，唐小龍，等．烏頭類藥材酯型生物堿含量測定方法的優(yōu)化［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（14）：101.

［4］ 劉祥東，梁瓊麟，羅國安，等．液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在醫(yī)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用［J］．藥物分析雜志，2005，25（1）：110．

［5］ 李蓓佳，向誠，楊秀偉，等．應(yīng)用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)研究通脈顆粒的指紋圖譜［J］．藥學(xué)學(xué)報，2010，45（11）：1410．

［6］ 劉永剛，劉倩，張宏桂，等．高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法研究烏頭堿的水解產(chǎn)物［J］．中國新藥雜志，2007，16（4）：303．

［7］ 黃勤安，張聿梅，何軼，等．烏頭堿水解轉(zhuǎn)化規(guī)律的研究［J］．中國中藥雜志，2007，32（20）：2143．

［8］ 黃志芳，唐小龍，羅恒，等．HPLC-Q-TOF-MS分析附子的化學(xué)成分及煎煮過程中的變化規(guī)律［J］．中國實驗方劑學(xué)雜志，2015，21（1）：57．

［9］ 陳蘭慧，金蓮姬，蘇忠民，等．烏頭堿類生物堿電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜行為及碎片離子穩(wěn)定性的量子化學(xué)計算［J］．高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2005，26（12）：2340．

［10］陳玉娟，王會堂，凡煉煉．烏頭堿的質(zhì)譜裂解行為分析［J］．科技創(chuàng)新導(dǎo)報，2010，7（2）：7．

［11］王峰峰，宋兆輝，張?zhí)m蘭，等．烏頭堿、新烏頭堿、次烏頭堿水解和醇解產(chǎn)物的研究［J］．中國中藥雜志，2012，37（11）：1564．

［12］Yue H，Pi Z.Studies on the aconitine-type alkaloids in the roots of Aconitum carmichaeli Debx.By HPLC/ESIMS/MS［J］. Talanta，2009，77（4）：1800.

［13］Wu SL，Liu F.8-O-Ethyl-yunaconitine from the roots of aconitum carmichaeli debx［J］.Acta Crystallogr Sect E Struct Rep Online，2012，68（Pt 7）：o2238.

［14］von Alred Kate，Hanspeter Rudin.Milde alkalische hydrolyse von aconitin［J］.Helvetica Chimica Acta，1984，67：2017.

［15］李錚，譚鵬，王春國，等.烏頭堿，中烏頭堿，次烏頭堿及水解產(chǎn)物的電噴霧質(zhì)譜裂解機制研究［J］.現(xiàn)代儀器，2011，7（2）：42.

Study on the Fragmentation Behavior and Alcoholysates of Aconitum Alkaloids in Aconitum Carmichaeli Debx

ZHANG Chi，PAN Delin，ZHU Yaning，et al.China Resources SanJiu（Ya'an）Pharmaceutical Co.，Ltd.，Sichuan，Ya'an 625000，China.

Objective：To investigate the pyrolysis mechanism of six alkaloids in Aconitum carmichaeli Debx，and identify their alcoholysates.Methods：HPLC-ESI-MS was used in this study.The first and multi-stage mass spectrum of aconitum alkaloids were obtained in positive ion mode.Results：Through the analysis of multi-stage mass spectrometry，the fragmentation patterns of six alkaloids were illuminated，and the alcoholysates of the diester alkaloids were identified.Conclusion：Three diester alkaloids are alcoholyzed in ethanol and generated three new products respectively，8-ethoxy-mesaconitine，8-ethoxy-aconitine and 8-ethoxy-hypaconitine；pyraconitine is generated at the same time because the reaction proceeds under heating.

Aconitum carmichaeli Debx；Aconitine；Diester alkaloids；Fragmentation regularity；Alcoholysate

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2278-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.021

2016-07-21）

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項（2013ZX09201018）

△通信作者（電子郵箱：zhangchi1728@163.com）