鐘銀玲李 花，3△劉旺華彭智遠(yuǎn)，2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)重點學(xué)科，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

·研究報告·

健脾補(bǔ)土法組方對腦缺血/再灌注損傷大鼠腦組織t-PA、PAI-1、ColⅣ的影響*

鐘銀玲1李 花1，3△劉旺華2，3，4彭智遠(yuǎn)1，2

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙，410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)重點學(xué)科，湖南 長沙 410208；3.湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410208；4.湖南中醫(yī)藥大學(xué)數(shù)字中醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 長沙 410208）

目的觀察健脾補(bǔ)土法組方對腦缺血/再灌注損傷大鼠t-PA、PAI-1、ColⅣ的影響，探討其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞可能作用機(jī)制。方法 將72只雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉組、健脾補(bǔ)土方小劑量組、健脾補(bǔ)土方中劑量組、健脾補(bǔ)土方大劑量組，每組12只。采用線栓法制備MCAO模型，治療7 d后處死，并在大鼠處死前進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定中組織型纖溶酶原激活物（t-PA）及組織型纖溶酶原激活物抑制物-1（PAI-1）的變化，運(yùn)用免疫組化法測定膠原蛋白Ⅳ（ColⅣ）的含量變化。結(jié)果與模型組相比，健脾補(bǔ)土小、中、大劑量組神經(jīng)功能缺損癥狀評分減少（P<0.05）；健脾補(bǔ)土方小、中、大劑量組t-PA表達(dá)明顯降低（P<0.05或P<0.01）；健脾補(bǔ)土方小、中、大劑量組PAI-1表達(dá)明顯升高（P<0.05或P<0.01）；健脾補(bǔ)土方小、中劑量組Col IV表達(dá)明顯升高（P<0.05）。結(jié)論健脾補(bǔ)土法組方能改善腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)缺損，可能與其下調(diào)t-PA及上調(diào)PAI-1的表達(dá)，從而減少細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解，上調(diào)ColⅣ的表達(dá)有關(guān)。

腦缺血/再灌注 健脾補(bǔ)土法 組織型纖溶酶原激活物 組織型纖溶酶原激活物抑制物-1 膠原蛋白Ⅳ

腦卒中是一類臨床常見病，具有高發(fā)病率、高病死率、高致殘率、高復(fù)發(fā)率的“四高”特點［1］。腦卒中可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中發(fā)生率達(dá)85%，其中，進(jìn)展性腦卒中占20%~40%［2］，常致患者遺留嚴(yán)重的功能殘疾。缺血性腦卒中易發(fā)生再灌注損傷。凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)的平衡失調(diào)在腦梗死發(fā)病機(jī)理中所起到的作用日益受到關(guān)注。t-PA、PAI是反應(yīng)體內(nèi)纖溶活性的重要指標(biāo)，纖溶狀態(tài)取決于t-PA和PAI的平衡情況。ColⅣ是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，具有支撐、保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)的作用。而健脾補(bǔ)土法組方對腦缺血疾病有保護(hù)作用，在臨床上也應(yīng)用于腦卒中的恢復(fù)期治療［3］。本研究采用改良Longa EZ等［4］線栓法建立大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型（MCAO模型），探討健脾補(bǔ)土法組方對t-PA、PAI-1、ColⅣ含量的影響及神經(jīng)功能缺損評分的影響，從而探討健脾補(bǔ)土法組方改善腦缺血/再灌注損傷大鼠神經(jīng)缺損與細(xì)胞外基質(zhì)、纖溶系統(tǒng)關(guān)系?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組 雄性SPF級SD大鼠72只，體質(zhì)量230~270 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物許可證號：SCSK（湘）2013-0004。動物合格證號：NO43004700006140。SPF級實驗室喂養(yǎng)，室溫20~25℃，相對濕度35%~65%。將72只SD雄性大鼠在造模前進(jìn)行初分組，按隨機(jī)數(shù)表法分為假手術(shù)組12只、模型制備組60只。將造模后的60只大鼠隨機(jī)分成模型組、依達(dá)拉奉組、健脾補(bǔ)土方小劑量組、健脾補(bǔ)土方中劑量組、健脾補(bǔ)土方大劑量組5組。每組12只。

1.2 藥物 健脾補(bǔ)土法組方藥物組成：人參15 g，白術(shù)12 g，茯苓10 g，黃芪15 g，山藥12 g，薏苡仁12 g，炙甘草6 g（各藥物從湖南中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院購買）。取各藥加水適量，浸泡2 h，水煎煮。第1次用6倍水，煎煮40~50 min；第2次用3倍水，煎煮30 min。2次水煎液混合，濃縮至生藥濃度為1 g/mL，滅菌分裝，4℃冷藏備用。依達(dá)拉奉注射液，吉林省博大制藥有限公司生產(chǎn)，批號80-140603，國藥準(zhǔn)字H20070051，規(guī)格10 mL/15 mg。

1.3 試劑與儀器 MK3酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK；ColⅣ免疫組化試劑盒，批號MK0749，武漢博士德生物工程有限公司提供。大鼠纖溶酶原激活物（t-PA）ELISA試劑盒，批號QY-R2058，武漢博士德生物工程有限公司提供。大鼠纖溶酶原激活物抑制物（PAI-1）ELISA試劑盒，批號SBJ-R0005，武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.4 模型制備 采用改良Longa EZ等的線栓法建立大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型 （MCAO模型），于缺血2 h后進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組除不插線外，其余過程同造模組。模型成功者納為研究對象，意外死亡大鼠由預(yù)備大鼠隨時補(bǔ)給。

1.5 給藥劑量與方式 給藥劑量根據(jù)70 kg成人每日服用82g生藥劑量按體表面積進(jìn)行換算，從手術(shù)后清醒后開始給藥，每日同一時間點給藥，連續(xù)給藥7 d。具體如下：假手術(shù)組（灌胃蒸餾水；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、模型組（灌胃蒸餾水；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、依達(dá)拉奉組（3.2 mg/kg，腹腔注射；灌胃蒸餾水）、健脾補(bǔ)土小劑量組（灌胃劑量3.69 g/kg，相當(dāng)于1/2臨床等效劑量；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、健脾補(bǔ)土中劑量組（灌胃劑量7.38 g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）、健脾補(bǔ)土大劑量組（灌胃劑量14.76g/kg，相當(dāng)于臨床等效劑量2倍；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液）。

1.6 標(biāo)本采集與檢測 1）給藥7 d后取材，從各組中隨機(jī)抽取6只大鼠，將大鼠經(jīng)10%水合氯醛麻醉后，迅速斷頭取腦放于冰盤上，小心剝離軟腦膜，取缺血區(qū)大腦皮層組織，將取的大腦皮層組織用冰PBS洗滌后放入消毒后EP管并標(biāo)記。80℃保存?zhèn)溆?。采用ELISA法檢測t-PA和PAI-1。向預(yù)存腦組織中加入PBS冰浴充分勻漿，3500 r/min離心15 min后取上清液，先向待測樣品孔中加入待測樣品，洗滌后加一抗工作液，充分反應(yīng)；洗滌后加酶標(biāo)抗體工作液，充分反應(yīng)；洗滌后加入底物工作液，充分反應(yīng)后加入終止液，酶標(biāo)儀450 nm波長下讀取吸光度值（OD值），以標(biāo)準(zhǔn)品之OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線公式換算含量。2）將每組余下的6只大鼠用10%水合氯醛麻醉后，固定后打開胸腔暴露心臟，經(jīng)左心室快速灌注生理鹽水200 mL，至流出液變清，再緩慢灌注4%多聚甲醛300 mL，至肝臟變硬白后斷頭取腦，切取左側(cè)視交叉后5 mm的冠狀切片，層厚為5 μm，置于4%多聚甲醛固定24 h以上。制成石蠟切片。采用免疫組化法檢測ColⅣ。將切片脫蠟至水，3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加ColⅣ抗體，37℃孵育2 h，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加聚合物輔助劑，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，滴加辣根酶標(biāo)記，抗兔IgG多聚體，37℃孵育20 min，PBS充分漂洗2 min×3次，DAB顯色液室溫下顯色，沖洗，復(fù)染、脫水、透明、封片。用PBS代替ColⅣ抗體作陰性對照。在大鼠腦缺血皮質(zhì)區(qū)同倍（400倍）的6個不同視野，用病理圖像分析軟件系統(tǒng)分析。統(tǒng)計每個視野下ColⅣ平均灰度值，取平均值。

1.7 神經(jīng)功能評分 根據(jù)國際公認(rèn)的大鼠腦卒中后神經(jīng)功能缺損評分法即mNSS評分［5］進(jìn)行神經(jīng)功能評分，采用雙盲法，缺血再灌注后第7日處死前2 h進(jìn)行評分。評判標(biāo)準(zhǔn)：1~6分為輕型受損；7~12為中型受損；13~18分為重型受損。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料以（s）表示。多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，組間兩兩比較方差齊者用LSD法檢驗，方差不齊者用Dunnet’s T3法檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)功能缺損評分比較 見表1。各造模組動物在造模清醒后均出現(xiàn)了神經(jīng)功能缺損癥狀，假手術(shù)組在造模清醒后及處死前都沒出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀。與假手術(shù)組相比，模型組的神經(jīng)功能缺損癥狀評分顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)拉奉組、健脾補(bǔ)土小劑量、健脾補(bǔ)土中劑量組、健脾補(bǔ)土大劑量組神經(jīng)功能缺損癥狀評分顯著降低（P<0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦組織ColⅣ表達(dá)水平比較（s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分及腦組織ColⅣ表達(dá)水平比較（s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組 別 n ColⅣ（ng/L） 神經(jīng)功能評分（分）假手術(shù)組 6 121.55±46.92 0.00±0.00模型組 6 51.34±13.15*9.17±2.14*依達(dá)拉奉組 6 87.42±20.73△4.83±1.17△△健脾補(bǔ)土小劑量組 6 90.29±35.71△6.67±1.37△△健脾補(bǔ)土中劑量組 6 89.16±14.76△5.17±2.14△△健脾補(bǔ)土大劑量組 6 78.18±18.41 5.00±2.00△△

2.2 健脾補(bǔ)土法組方對ColⅣ表達(dá)的影響 見表1。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中ColⅣ表達(dá)明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)拉奉組及健脾補(bǔ)土方小、中劑量組ColⅣ表達(dá)明顯升高（P<0.05）。2.3 各組t-PA、PAI-1水平比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中t-PA、PAI-1表達(dá)明顯升高（P<0.01）；與模型組比較，依達(dá)拉奉組及健脾補(bǔ)土方中、大劑量組t-PA表達(dá)明顯降低（P<0.05或P<0.01），依達(dá)拉奉組及健脾補(bǔ)土方小、中、大劑量組PAI-1表達(dá)明顯升高（P<0.05或P<0.01）。

3 討 論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦結(jié)構(gòu)和功能的物質(zhì)基礎(chǔ)為“血氣”與“精氣”，腦的正?；顒有铓庋蛞旱淖甜B(yǎng)［6］。脾胃為后天之本，氣血津液生化之源。故有“內(nèi)傷脾胃，百病由生”之說。本研究健脾補(bǔ)土組方是在中醫(yī)辨證論治和整體觀念指導(dǎo)下由多味中藥配伍而成［7］，其中四君子湯為治療脾胃氣虛的基本方［8］，方中人參甘溫益氣；白術(shù)健脾燥濕；茯苓健脾滲濕；炙甘草益氣和中，調(diào)和諸藥；山藥能補(bǔ)脾益氣，補(bǔ)腎滋陰；黃芪能保護(hù)脾胃升發(fā)之氣，且能避免苦寒之品傷脾敗胃；脾虛則生濕，故加薏苡仁利水健脾滲濕。諸藥配伍地當(dāng)，健脾補(bǔ)土之功尤著。

表2 各組大鼠腦組織t-PA、PAI-1表達(dá)水平比較（s）

表2 各組大鼠腦組織t-PA、PAI-1表達(dá)水平比較（s）

組 別 n t-PA（ng/L） PAI（ng/L）假手術(shù)組 6 242.96±72.44 101.31±22.91模型組 6 543.29±112.67**189.86±24.94**依達(dá)拉奉組 6 406.62±148.01△319.48±27.66△△健脾補(bǔ)土小劑量組 6 339.13±122.11△△284.94±41.43△健脾補(bǔ)土中劑量組 6 383.00±89.73△299.49±50.33△健脾補(bǔ)土大劑量組 6 342.51±93.53△△338.90±70.93△

神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)的破壞和降解在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮重要作用［9］。ECM是由細(xì)胞合成并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子，不僅在支持、連接和維持組織形態(tài)方面起重要作用，而且具有調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、生長、分化、促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、離子交換和信息傳遞的功能。膠原（Col）是細(xì)胞外基質(zhì)的重要成分之一，可與細(xì)胞表面上的特異性受體結(jié)合，通過受體與細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)直接聯(lián)系或通過細(xì)胞內(nèi)的一系列信號傳導(dǎo)而引起不同的下游基因的表達(dá)［10］。本課題前期研究［3，7，9，11］結(jié)果顯示，經(jīng)健脾補(bǔ)土方藥治療后，腦卒中患者M(jìn)MSE、ADL、HDS量表得分均有明顯升高，表明健脾補(bǔ)土方藥對改善缺血性腦卒中患者后遺癥有較好療效；健脾補(bǔ)土法對腦缺血/再灌注（I/R）損傷后大鼠神經(jīng)功能評分有改善，能降低神經(jīng)元凋亡指數(shù)，保護(hù)血腦屏障，抑制NF-κB炎癥信號通路，增加某些ECM成分如LN表達(dá)和減少基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)。

人體的纖溶系統(tǒng)主要由纖溶酶原、纖溶酶、纖溶酶原激活物和纖溶酶原激活劑抑制劑組成［12］。t-PA及PAI是反應(yīng)體內(nèi)纖溶活性的重要指標(biāo)，纖溶狀態(tài)取決于t-PA和PAI的平衡情況，PAI與t-PA形成1∶1復(fù)合物，使t-PA失活［13］。t-PA是纖溶系統(tǒng)的主要激活劑，它通過激活纖溶酶原形成纖溶酶而溶解纖維蛋白，生成纖維蛋白降解產(chǎn)物。近年來國內(nèi)有關(guān)t-PA與細(xì)胞外基質(zhì)關(guān)系的研究不多。有研究表明［14］，t-PA可能通過產(chǎn)生纖溶酶原以及激活基質(zhì)金屬蛋白酶而在細(xì)胞外基質(zhì)降解過程中起重要作用。也有研究顯示［15］，腦梗死患者血漿t-PA及PAI-1活性均高于正常組，且t-PA增高幅度較PAI-1大，體內(nèi)纖溶系統(tǒng)相對亢進(jìn)。有動物實驗［16］表明，MCAO大鼠在腦缺血再灌注損傷后，神經(jīng)元及血管內(nèi)皮細(xì)胞t-PA表達(dá)增加。

本實驗結(jié)果顯示，在腦缺血在灌注后，模型組t-PA及PAI活性均高于正常組，且t-PA增高幅度較PAI大，而檢測的模型組大鼠缺血側(cè)腦組織中ColⅣ表達(dá)明顯降低，可以推測在腦缺血再灌注后纖溶活性增強(qiáng)，作為纖溶系統(tǒng)主要激活劑的t-PA很有可能激活金屬基質(zhì)蛋白酶而參與細(xì)胞外基質(zhì)比如ColⅣ降解過程。這種推測與本課題前期研究結(jié)果相符合。在連續(xù)給藥7 d后，依達(dá)拉奉組、健脾補(bǔ)土小劑量、健脾補(bǔ)土中劑量組、健脾補(bǔ)土大劑量組神經(jīng)功能缺損癥狀評分減少，能不同程度降低t-PA的表達(dá)，抑制了纖溶系統(tǒng)活性，且升高ColⅣ表達(dá)，減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞。其保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用的具體機(jī)制仍有待研究，可能與藥物劑量及治療的時間長短等有關(guān)。

［1］ 徐添.腦卒中發(fā)病與預(yù)后的前瞻性隊列研究［D］.蘇州：蘇州大學(xué)，2014.

［2］ 李霞，喬淑冬，范常鋒.急性缺血性腦卒中的進(jìn)展與腦血管狹窄的關(guān)系［J］.中國醫(yī)刊，2016，51（12）：43-46.

［3］ 李花，劉旺華，廖亮英，等.健脾補(bǔ)土方藥治療缺血性腦卒中后遺癥療效觀察［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2010，17（3）：73-74.

［4］ Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebralartery occlusion without cranietomy in rats［J］.Stroke，1989，20（1）：84-91.

［5］ Zaidi HA，Zabramski JM，Safavi-Abbasi S，et al.Spontanceous intracerebral hemorrhagc［J］.World Neurosurg， 2015，84（5）：1191-1192.

［6］ 趙步長.中醫(yī)腦心同治論［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：22.

［7］ 付小金，劉旺華，李花，等.健脾補(bǔ)土方對腦缺血再灌注損傷大鼠NF-κB和IKBA蛋白表達(dá)水平的影響［J］.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，25（3）：5-8.

［8］ 鄧中甲.方劑學(xué)［M］.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2010：151.

［9］ 劉旺華，李花，周小青.論細(xì)胞外基質(zhì)與中醫(yī)脾土相關(guān)及其對腦缺血保護(hù)的啟示.中國中醫(yī)藥信息雜志［J］.2010，17（3）：5-6.

［10］Stafford DW.Extravascular FIX and coagulation［J］.Thrombosis Journal，2016，14（1）：35.

［11］李花，劉旺華，廖亮英，等.健脾補(bǔ)土法對大鼠腦缺血再灌注后層粘連蛋白降解的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2010，12（7）：645-647.

［12］朱進(jìn)霞.醫(yī)學(xué)生理學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2015：68.

［13］盧波，韓莉，呂志昆，等.急性腦梗死患者血清炎性因子、t-PA、PAI-1變化規(guī)律及意義［J］.疑難病雜志，2015，14（9）：906-908.

［14］Hosomi N，Lucero J，Heo JH，et al.Rapid differential endogenous plasminogen activator expression after acute middle cerebralartery occlusion［J］.Stroke，2001，32（1）：1341-1348.

［15］汪效松.腦梗死患者血漿t-PA、PAI-1及D-二聚體含量變化及臨床意義［J］.疑難病雜志，2007，8（6）：483-484.

［16］邵延坤，楊宏，徐忠信，等.局灶性腦缺血/再灌注損傷后大鼠腦組織t-PA表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡研究［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2002，19（5）：262-264.

The Effect of Spleen-strengthening Therapy on t-PA and PAI and Col IV in Rats with Cerebral Ischemi-a/Reperfusion Injury

Z HONG Yinling，LI Hua，LIU Wanghua，et al. School of Traditional Chinese Medicine of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410208，China.

Objective：To study the effect of Spleen-strengthening therapy on t-PA，PAI-1 and ColⅣand in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury and investigate its possible mechanism.Methods：72 male SD rats were randomly divided into sham-operation group，modelling group，edaravone group and low-dosed spleenstrengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group，high-dosed spleen-strengthening group，12 in each group.The models of MCAO were induced by middle cerebral artery occlusion and recanalization executed after treatment of 7 days，and nerve function defect score of the rats was evaluated before death.ELISA was used to detect the expression levels of t-PA and PAI-1.Immunohistochemical staining was used to detect the expression levels of ColⅣ.Results：Compared with the modelling group，nerve function defect score was obviously decreased（P<0.05）in low-dosed spleen-strengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group and highdosed spleen-strengthening group.Compared with the modelling group，the expression of t-PA was obviously decreased（P<0.05 or P<0.01）and PAI was obviously increased（P<0.05 or P<0.01）in low-dosed spleenstrengthening group，middle-dosed spleen-strengthening group and high-dosed spleen-strengthening group.Compared with the modelling group，the expression of ColⅣwas obviously increased（P<0.05）in low-dosed spleenstrengthening group and middle-dosed spleen-strengthening group.Conclusion：Spleen-strengthening therapy decreases neurological deficit in rats with cerebral ischemia/reperfusion injury.The mechanism may be the inhibi-tion of the expression of t-PA and promotion of the expression of PAI，which promotes the expression of ColⅣand reduces the degradation of ECM.

Cerebral ischemia/reperfusion；Spleen-strengthening therapy；t-PA；PAI-1；ColⅣ

R285.5

A

1004-745X（2016）12-2213-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2016.12.002

2016-09-19）

國家自然科學(xué)基金項目（81202632、81473567）；教育部博士點基金項目（20124323120003）；湖南省自然科學(xué)基金項目（13JJ3097）；湖南省教育廳優(yōu)秀青年基金項目（14B134）；湖南省教育廳高校創(chuàng)新平臺基金項目（15K092）

△通信作者（電子郵箱：flora119@sina.com）