·國(guó)外醫(yī)學(xué)動(dòng)態(tài)·

生物毒素的研究與應(yīng)用：選擇性蜘蛛毒揭示Nav1.1通道在機(jī)械痛中的作用

電壓門(mén)控性鈉（Nav）通道參與啟動(dòng)大多數(shù)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢?，其中也包括痛覺(jué)初級(jí)傳入神經(jīng)纖維。局部麻醉劑可通過(guò)非特異性阻斷所有Nav通道亞型來(lái)抑制疼痛，但探求選擇性亞型調(diào)節(jié)因子將更有助于分析Nav通道亞型對(duì)化學(xué)、機(jī)械或熱痛的作用及機(jī)制。美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校的Jeremiah D. Osteen, Volker Herzig和 David Julius等人通過(guò)運(yùn)用電生理、組織化學(xué)及行為學(xué)，篩選和鑒定出一種蜘蛛毒素可選擇性激活Nav1.1亞基，并闡明其在傷害感受和疼痛中的作用。在非神經(jīng)炎癥的情況下，Nav1.1的激活誘導(dǎo)了疼痛反應(yīng)，產(chǎn)生了機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，而對(duì)熱痛并無(wú)影響。在腸道中，高閾值機(jī)械敏感性神經(jīng)纖維表達(dá)Nav1.1，且腸易激綜合征模型小鼠也表現(xiàn)為毒素敏感性增強(qiáng)，證實(shí)了Nav1.1通道在調(diào)節(jié)機(jī)械痛的感覺(jué)神經(jīng)纖維興奮性中的作用。

一、研究背景

疼痛不但引起急性、保護(hù)性的反應(yīng)，也引起不良反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致持續(xù)性疼痛。在這些傷害性感受神經(jīng)元中，三種電壓門(mén)控性Na通道—Nav1.7,Nav1.8和Nav1.9得到了特別的關(guān)注，主要因?yàn)槭芡蛔冇绊懙倪@些亞型與持續(xù)性疼痛綜合癥有關(guān)。此外，Nav1.1也在軀體感覺(jué)神經(jīng)元中表達(dá)，但這種亞型與疼痛之間的關(guān)系目前并未可知。研究顯示，受突變影響的Nav1.1與中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ绨d癇、自閉癥和阿爾茨海默病）相關(guān)。在外周神經(jīng)元中，臨床研究顯示該亞型可能也具有潛在的功能。例如，Nav1.1的功能獲得性突變引起III型家族偏癱性偏頭痛。盡管該表型是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)啟動(dòng)機(jī)制，感覺(jué)神經(jīng)元的失功能也可能促進(jìn)這種疼痛綜合征的發(fā)生。

確定Nav1.1在疼痛中作用的另一個(gè)挑戰(zhàn)是開(kāi)發(fā)出這種高度保守的離子通道家族成員的亞型選擇性藥物。天然藥物可被用來(lái)作為對(duì)靶受體特異性作用物質(zhì)的一種來(lái)源。這種藥物可能存在于蜘蛛、蝎子、錐螺和蛇的復(fù)雜毒液中，它們所包含的毒素可刺激攻擊它們的捕食者的感覺(jué)感受器來(lái)引起疼痛及不適。在該報(bào)道中，作者闡述了兩種選擇性激活Nav1.1引發(fā)急性疼痛和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏的致痛性蜘蛛毒素，為該通道和表達(dá)Nav1.1的感覺(jué)神經(jīng)纖維在傷害感受和痛覺(jué)過(guò)敏中的特異性作用提供了新思路。

二、主要研究結(jié)果

1. Hm1a選擇性激活Nav1.1

為了鑒定靶向特定傷害性感受器的新毒素，運(yùn)用鈣成像技術(shù)測(cè)試100多只蜘蛛、蝎子和蜈蚣毒液對(duì)培養(yǎng)的軀體感覺(jué)神經(jīng)元的激活能力。其中，多哥星團(tuán)樹(shù)巴布狼蛛(tarantula Heteroscodra maculata)毒液可強(qiáng)烈地刺激大/小鼠三叉神經(jīng)節(jié)(TG)及背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元。應(yīng)用MALDI-TOF MS和帶相關(guān)序列的抑制劑胱氨酸結(jié)(ICK)肽的埃德曼測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)毒液可分離出兩種活性肽，分別命名為Hm1a和Hm1b。隨之，應(yīng)用合成的Hm1a，結(jié)果顯示其可引起大鼠DRG神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)鈣反應(yīng)，提示Hm1a是一種有活性的毒液成分。

河豚毒素TTX可阻斷Hm1a所誘發(fā)的鈣反應(yīng)，表明這些反應(yīng)與Nav通道有關(guān)。全細(xì)胞膜片鉗記錄TG神經(jīng)元，結(jié)果顯示Hm1a顯著抑制了Nav電流的失活。這些神經(jīng)元所表達(dá)的Nav亞型中，只有Nav1.1，1.6和1.7對(duì)TTX是敏感的，縮小了其研究范圍。下一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ICA-121431，一種Nav1.1和Nav1.3亞型選擇性的小分子抑制劑，可減弱胚胎鼠DRG和新生鼠三叉培養(yǎng)系中由Hm1a誘發(fā)的鈣離子反應(yīng)，表明在軀體感覺(jué)神經(jīng)元中Nav1.1是Hm1a主要的靶點(diǎn)。作為對(duì)照，ICA-121431僅部分阻斷SGTx1的反應(yīng)。同Hm1a相比，它在Nav亞型中表現(xiàn)出更低的選擇性且可激活更多的感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞群。為了證實(shí)該毒素對(duì)Nav1.1通道是選擇性的，我們?cè)诜侵拮嘎涯讣?xì)胞中異源表達(dá)Nav1.1-Nav1.8 α亞基。Hm1a有效地抑制了人類(h) Nav1.1通道的失活（半數(shù)有效濃度EC50=38±6 nM），但卻大幅度減弱了對(duì)hNav1.2和hNav1.3的影響，對(duì)hNav1.4-Nav1.8無(wú)影響。天然Hm1b可獲得相似的結(jié)果。Nav1.9在重組體系統(tǒng)中并不是高效表達(dá)，但替代的嵌合體（大鼠Kv2.1通道包含來(lái)自每個(gè)hNav1.9的四個(gè)結(jié)構(gòu)域的S3b-S4毒素結(jié)合域）也對(duì)毒素不敏感。

以前Hm1b是一種未知毒素，但Hm1a是第一個(gè)作為κ-theraphotoxin-Hm1a被鑒定的，是一種電壓門(mén)控通道Kv1.4的中度親和力阻斷劑。然而，高濃度的合成Hm1a對(duì)小鼠Kv4.1電流的阻斷作用僅能達(dá)到20%，且1 μM天然Hm1a對(duì)Nav1.1表現(xiàn)出飽和效應(yīng)卻并不阻斷mKv4.1。此外，在培養(yǎng)的感覺(jué)神經(jīng)元中，外向K+電流并沒(méi)有受到Hm1a的影響，表明它的主要靶點(diǎn)是Nav1.1。該結(jié)果或許可以解釋為什么向小鼠腦注射Hm1a引起了抽搐和迅速死亡。這些結(jié)果也證明了Hm1a是通過(guò)選擇性靶向Nav1.1通道來(lái)激活一系列的感覺(jué)神經(jīng)元。

用全細(xì)胞電流鉗配置分析三叉神經(jīng)元Hm1a反應(yīng)表明這是毒素誘發(fā)的過(guò)度興奮。Hm1a并不改變靜息膜電位RMP，但它在注入20 pA電流時(shí)極大地增強(qiáng)了放電頻率。Hm1a也顯著延長(zhǎng)了動(dòng)作電位。我們發(fā)現(xiàn)毒素反應(yīng)最強(qiáng)烈的是來(lái)自幼小的（胚胎或新生）小鼠和大鼠的培養(yǎng)的感覺(jué)神經(jīng)元，可能反映了在這些細(xì)胞或培養(yǎng)條件中動(dòng)作電位放電閾值更低。

2. 選擇性依賴于IV型結(jié)構(gòu)域的S1-S2環(huán)

研究表明Hm1a抑制Nav1.1快速失活的速度和程度，與少數(shù)的選擇性肽類毒素結(jié)合到IV型結(jié)構(gòu)域的S3b-S4電壓傳感區(qū)域的機(jī)制類似。為了檢測(cè)Hm1a是否靶向相同的位置，作者分別將hNav1.1的四個(gè)S3b–S4結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)移至四聚體rKv2.1電壓門(mén)控鉀通道所在的同源位點(diǎn)上，該位置通常對(duì)毒素不敏感。僅DIV S3b-S4結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)移可釋放rKv2.1對(duì)Hm1a的敏感性，證明了該部分是毒素起作用的主要決定因素。然而，這段區(qū)域在hNav1.1，hNav1.2 和hNav1.3中都是相同且相對(duì)保守的，因此這不能完全解釋毒素的選擇性。為了驗(yàn)證其他重要區(qū)域的功能性，作者在Nav1.1和Nav1.4之間構(gòu)建了嵌合體，它對(duì)Hm1a完全不敏感。將rNav1.4和hNav1.1的S3b–S4結(jié)構(gòu)域進(jìn)行替換后就失去了毒素的敏感性，反之將S3b–S4和S1–S2環(huán)轉(zhuǎn)移進(jìn)入后能完全導(dǎo)致毒素敏感性。這些結(jié)果說(shuō)明這些結(jié)構(gòu)域一起決定了毒素敏感性和亞型選擇性。

3. Nav1.1在有髓鞘的Aδ纖維上表達(dá)

通過(guò)原位雜交的方法，我們發(fā)現(xiàn)Nav1.1轉(zhuǎn)錄本主要表達(dá)于中等直徑的感覺(jué)神經(jīng)元（占DRG中所有神經(jīng)元的35%），這些神經(jīng)元大部分（＞75%）屬于有髓鞘群體（NF200陽(yáng)性）。作為對(duì)照，我們發(fā)現(xiàn)只有（5%～11%）的Nav1.1陽(yáng)性神經(jīng)元與小直徑神經(jīng)元標(biāo)記物，無(wú)髓鞘神經(jīng)元標(biāo)記物包括TRPV1、CGRP、酪氨酸羥化酶和凝集素IB4有共標(biāo)。但是，我們看到Nav1.1陽(yáng)性神經(jīng)元與有髓鞘Aδ神經(jīng)元的標(biāo)記物5-HT3受體有大量共標(biāo)（43%的Nav1.1陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)5-HT3）。最后，22%的Nav1.1陽(yáng)性神經(jīng)元也表達(dá)TRPM8受體，TRPM8受體在Aδ和C纖維中都有發(fā)現(xiàn)。從上面結(jié)果我們總結(jié)出Nav1.1主要表達(dá)在有髓鞘神經(jīng)元包括Aδ纖維中，與之前的組織學(xué)和轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)一致。我們也概括出Hm1a敏感性神經(jīng)元對(duì)其他受體選擇性激動(dòng)劑有反應(yīng)這一特征，進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。顯而易見(jiàn)地，大部分（＞ 85%）的Nav1.1陽(yáng)性神經(jīng)元同樣表達(dá)Nav1.7，說(shuō)明這類髓鞘神經(jīng)元對(duì)傷害性感受起到一定的作用。接下來(lái)我們采用離體皮膚神經(jīng)制備實(shí)驗(yàn)來(lái)研究Hm1a對(duì)機(jī)械性傷害感受的Aδ纖維中的作用。我們發(fā)現(xiàn)在皮膚感受區(qū)處理1μM Hm1a可顯著地增加機(jī)械性傷害感受的Aδ纖維對(duì)機(jī)械刺激的反應(yīng)的放電頻率，這些證實(shí)了功能性Nav1.1在傳入神經(jīng)的表達(dá)。之前的研究結(jié)果表明TRPV1在機(jī)械性傷害感受的Aδ纖維中少量表達(dá)，這與我們發(fā)現(xiàn)的Nav1.1和TRPV1只有少量共標(biāo)相一致。同時(shí)，這些功能性結(jié)果證明了Nav1.1表達(dá)在有髓鞘的Aδ纖維，也進(jìn)一步說(shuō)明Nav1.1參與了機(jī)械性傷害感受。

4. Hm1a引發(fā)疼痛和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏

我們研究了表達(dá)Nav1.1的纖維的激活是否會(huì)產(chǎn)生疼痛行為。將Hm1a（5 μM/10 μl）注射進(jìn)入小鼠后爪，在整個(gè)觀察期間小鼠產(chǎn)生了迅速而強(qiáng)烈的傷害性反應(yīng)（反復(fù)舔咬注射的爪）。在淺層同側(cè)的脊髓背角神經(jīng)元中注射毒素同樣可明顯增加Fos蛋白免疫反應(yīng)，說(shuō)明傷害性感受器和它的中樞有功能性銜接。為了排除這個(gè)反應(yīng)是賴于TRPV1和Nav1.1共標(biāo)的那一小部分纖維的可能性，我們通過(guò)鞘內(nèi)注射辣椒素來(lái)脫敏TRPV1陽(yáng)性末端，Hm1a誘發(fā)的傷害性反應(yīng)在這樣處理的小鼠中依然持續(xù)。顯而易見(jiàn)的，被注射過(guò)Hm1a的爪子不會(huì)有腫脹或血漿外滲的反應(yīng)，而肽能C纖維傷害性感受器的激活容易誘發(fā)神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)，這些感受器包括了大部分的TRPV1表達(dá)的神經(jīng)元。這些結(jié)果進(jìn)一步顯示Hm1a是通過(guò)激活非肽能有髓鞘感覺(jué)神經(jīng)纖維來(lái)誘發(fā)痛。通過(guò)遺傳或藥理學(xué)方法敲除TRPV1表達(dá)纖維能極大的降低傷害性熱敏，但對(duì)機(jī)械刺激敏感無(wú)影響。鑒于解剖和生理的結(jié)果，通過(guò)監(jiān)測(cè)足底注射不足以引起急性行為的的毒素劑量（500 nM,10μl）后熱刺激和機(jī)械刺激的反應(yīng)檢測(cè)Hm1a在其中是否有不同的影響。足底注射Hm1a后并不改變熱敏，但是對(duì)機(jī)械刺激產(chǎn)生很強(qiáng)的敏化作用且不依賴于TRPV1表達(dá)纖維。注射Hm1b后能夠看到相似的機(jī)械敏感變化。與這些行為學(xué)結(jié)果相符，除了那些也對(duì)辣椒素敏感的神經(jīng)之外，所有Hm1a陽(yáng)性成年DRG神經(jīng)元展示出機(jī)械活化電流。

為了確認(rèn)Nav1.1在毒素誘導(dǎo)的行為學(xué)中的作用，我們雜交小鼠Nav1.1等位基因去線性表達(dá)受外周蛋白啟動(dòng)子控制的Cre重組酶，這在發(fā)育期間有很大比例的有髓和無(wú)髓感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)活躍。分析外周蛋白-Cre X黃色熒光蛋白（YFP）受體線性關(guān)系表明46%的Nav1.1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)Cre重組酶。值得注意的是，從這些纖維群中去除Nav1.1能夠明顯減弱毒素誘發(fā)的行為學(xué)，包括急性疼痛反應(yīng)和機(jī)械性致敏。通過(guò)神經(jīng)損傷或炎癥強(qiáng)烈的激活傷害感受途徑具有原發(fā)性和繼發(fā)性敏化作用，后者可以表現(xiàn)為對(duì)側(cè)對(duì)刺激的機(jī)械或熱超敏反應(yīng)。事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)單側(cè)注射Hm1a在注射的同側(cè)及對(duì)側(cè)都產(chǎn)生強(qiáng)烈且相似的機(jī)械性致敏。重要的是，Hm1a介導(dǎo)的機(jī)械性致敏在Nav1.1外周蛋白Cre小鼠的同側(cè)及對(duì)側(cè)足底均會(huì)減低，證明對(duì)側(cè)的敏化作用依賴于Nav1.1。

5. Nav1.1和腸易激綜合征

腸易激綜合征（IBS）患者腹痛的發(fā)生是慢性機(jī)械性超敏反應(yīng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)。鑒于Nav1.1在機(jī)械傷害感受器中的作用，我們研究這個(gè)通道是否表達(dá)于內(nèi)臟的機(jī)械敏感纖維，如果是，那么它對(duì)慢性內(nèi)臟超敏模型（CVH）中神經(jīng)元的敏化是否起到作用。我們檢測(cè)來(lái)自于正常及CVH小鼠的離體內(nèi)臟神經(jīng)的機(jī)械響應(yīng)。在正常小鼠中，Hm1a增加40%的高閾值慢性結(jié)腸傳入神經(jīng)（構(gòu)成假定的機(jī)械傷害感受器）中的機(jī)械誘發(fā)的spiking。相應(yīng)地，ICA-121431降低50%的纖維研究的機(jī)械響應(yīng)并阻斷Hm1a誘發(fā)的敏化作用。此外，Hm1a顯著降低45%的逆行標(biāo)記的結(jié)腸DRG神經(jīng)元的動(dòng)作電位的發(fā)放閾值，結(jié)果通過(guò)全細(xì)胞電流鉗分析得出。這些結(jié)果表明高閾值機(jī)械敏感性結(jié)腸纖維表達(dá)功能性Nav1.1通道。CVH小鼠的結(jié)腸傳入神經(jīng)的基線機(jī)械感覺(jué)反應(yīng)較正常對(duì)照小鼠有所升高。Hm1a的應(yīng)用提高了36%CVH纖維的機(jī)械誘發(fā)spiking，超過(guò)其本身提升的水平。尤其，在CVH的情況下（與正常對(duì)照組形成對(duì)比），毒素的使用顯著增加多數(shù)（64%）逆行標(biāo)記結(jié)腸DRG神經(jīng)元的電興奮性，表明Nav1.1通道的功能性上調(diào)。此外，ICA-121431使多數(shù)（70%）CVH敏感纖維的機(jī)械感覺(jué)傳導(dǎo)反應(yīng)降低到類似于基線水平。同時(shí)，這些結(jié)果支持Nav1.1在IBS中參與機(jī)械超敏反應(yīng)這一觀點(diǎn)。

三、總結(jié)

Nav通道的亞型選擇性配體的開(kāi)發(fā)是一個(gè)重要但具有挑戰(zhàn)性的目標(biāo)。我們的研究結(jié)果確定了在DIV S1-S2環(huán)內(nèi)有個(gè)點(diǎn)可增強(qiáng)亞型選擇性，為設(shè)計(jì)其他亞型特異性門(mén)控調(diào)節(jié)器提供了一個(gè)潛在的方案。此外，毒素如Hm1a和Hm1b可能特定地作用于激發(fā)Nav通道活性，然而Nav通道部分功能喪失與神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默病和兒嚴(yán)重肌陣攣癲癇有關(guān)系。毒素和離子通道相互作用的分析，包括該藥效團(tuán)的多位點(diǎn)種類，可能為開(kāi)發(fā)更廣泛的一類帶有相似選擇性和功能性配置的分子提供新的策略。Nav1.1在大腦中的關(guān)鍵性的作用可能是阻礙它經(jīng)過(guò)前識(shí)別成為外周疼痛信號(hào)的貢獻(xiàn)者。目前我們的結(jié)果明確表明Nav1.1和表達(dá)Nav1.1的有髓鞘傳入神經(jīng)在傷害感受中的重要作用。在沒(méi)有引起神經(jīng)源性炎癥情況下激活或敏化這些纖維足以引起強(qiáng)烈的急性疼痛和機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏，這些纖維有別與己被充分研究的C-傷害性感受器。先前的研究涉及到有髓鞘的Aδ纖維在傷害性感受機(jī)理中，且目前Nav1.1為更精確地鑒定這些纖維對(duì)急性和慢性疼痛的作用提供了一個(gè)重要的新對(duì)照。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，用藥理學(xué)方法阻斷Nav1.1代表了一種新的治療策略來(lái)減弱IBS中的慢性疼痛，或許這對(duì)其他疼痛（偏頭痛與機(jī)械性致敏）也有治愈作用。盡管大腦Nav1.1活動(dòng)可能會(huì)導(dǎo)致III型家族偏癱性偏頭痛患者的發(fā)作先兆，我們的結(jié)果表明這些功能獲得性突變?cè)跈C(jī)械性痛覺(jué)感受器中可能會(huì)通過(guò)Nav1.1的活動(dòng)產(chǎn)生偏頭痛。實(shí)際上，抗痙攣藥可靶向Nav通道，包括Nav1.1，已被證明可減輕某些個(gè)體的偏頭痛發(fā)作。此外，盧非酰胺，即一種鎮(zhèn)痙劑最近被證明能夠抑制Nav1.1。報(bào)道顯示，其可減輕神經(jīng)損傷誘發(fā)的機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏。我們的發(fā)現(xiàn)為這些研究提供了一個(gè)深入機(jī)制。

（Jeremiah D. Osteen, Volker Herzig, John Gilchrist,et al. ARTicLE,2016, 534:494 ～ 499. 蘇州大學(xué) , 余書(shū)敏 譯 陶金 校）

10.3969/j.issn.1006-9852.2017.02.002