狄劍士，鄭桂麗，李夢巖，李鍇男，王寶成

胃癌根治術(shù)后患者血循環(huán)腫瘤細胞的檢測及其意義

狄劍士，鄭桂麗，李夢巖，李鍇男，王寶成

胃癌；循環(huán)腫瘤細胞；根治術(shù)后

胃癌目前仍是我國發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，5年生存率僅為10%左右，其術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是死亡的主要原因［1］。 循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是發(fā)生微轉(zhuǎn)移的必要步驟［2］，與腫瘤血液轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)性，提示在常規(guī)的影像學(xué)診斷之前可能已有腫瘤微轉(zhuǎn)移灶的發(fā)生。2013年10月—2014年4月筆者利用免疫磁珠陰性富集法對60例胃癌患者術(shù)后外周血中的CTCs進行檢測，并討論CTCs與臨床分期的相關(guān)性。

1 資料與方法

1．1 一般資料60例胃癌首次根治術(shù)后未行化療患者。男37例，女23例；年齡36～83歲，中位年齡58歲。乳頭狀腺癌 14例，管狀腺癌 7例 ，黏液腺癌 4例，印戒細胞癌 6例 ，低分化腺癌17例，未分化癌12例。根據(jù)TNM分期分為Ⅰ期11例，Ⅱ期21例，Ⅲ期28例。

1．2 方法所有研究對象均采用真空采血管采集肘正中靜脈血3．2 ml（不含抗凝藥）于ACD抗凝管中。采用免疫磁珠富集技術(shù)分離CTCs，用熒光原位雜交和免疫熒光染色鑒別CTCs，在熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計CTCs。判讀標(biāo)準(zhǔn)為DAPI+（單核），細胞核內(nèi)FISH信號點＞2個，且無血源性白細胞表面抗原著色，即CD45-。外周血中CTCs計數(shù)＞2個／3．2ml定義為CTCs陽性。同時隨訪患者術(shù)后2年的病情變化。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17．0統(tǒng)計學(xué)軟件分析，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期各組間的CTCs陽性率、血液轉(zhuǎn)移比較，采用χ2分析，以P＜0．01為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同臨床分期胃癌患者術(shù)后CTCs檢測結(jié)果比較60例胃癌根治術(shù)患者外周血中CTCs陽性率為43．3%（26／60），分別為Ⅰ期9．1%（1／11），Ⅱ期為33．3．%（7／21），Ⅲ期為64．3．%（18／28），Ⅲ期陽性率與Ⅰ期、Ⅱ期相比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。見表1。

2.2 不同臨床分期胃癌患者術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)果比較60例胃癌根治術(shù)外周血中CTCs陽性患者，Ⅰ期CTCs陽性患者2年內(nèi)未轉(zhuǎn)移；Ⅱ期CTCs陽性患者6～12個月無轉(zhuǎn)移，12～24個月出現(xiàn)轉(zhuǎn)移4例，其中肝轉(zhuǎn)移2例，肝肺同時轉(zhuǎn)移1例，骨轉(zhuǎn)移1例；Ⅲ期CTCs陽性患者6～12個月內(nèi)肝轉(zhuǎn)移1例，12～24個月出現(xiàn)轉(zhuǎn)移8例，其中肝臟轉(zhuǎn)移2例，肝、肺和骨同時轉(zhuǎn)移3例，骨轉(zhuǎn)移1例，肺和顱內(nèi)轉(zhuǎn)移分別1例。轉(zhuǎn)移率Ⅲ期高于Ⅱ期和Ⅰ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）（表2）。

表 1 不同臨床分期胃癌患者術(shù)后CTCs檢測結(jié)果的比較

表 2 不同臨床分期胃癌患者術(shù)后2年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移結(jié)果的比較

3 討論

澳大利亞的Ashworth于1869年首次提出循環(huán)腫瘤細胞的概念，循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是指惡性腫瘤從原發(fā)灶和或轉(zhuǎn)移灶脫落進入血液循環(huán)的腫瘤細胞。CTCs來源于實體瘤，通過基因轉(zhuǎn)錄、蛋白修飾和細胞表型的改變增強其侵襲力，再經(jīng)過誘發(fā)新生血管生成或經(jīng)周圍血管系統(tǒng)進入循環(huán)系統(tǒng)，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在此環(huán)節(jié)中發(fā)揮重要的作用［3］。進入血液循環(huán)的腫瘤細胞大部分發(fā)生凋亡或被機體自身免疫系統(tǒng)吞噬及血液的剪切作用而死亡，也可被抗腫瘤治療清除，僅有少數(shù)的CTCs能成活下來，形成新的轉(zhuǎn)移灶。所以發(fā)現(xiàn)CTCs并不能證明一定有轉(zhuǎn)移灶形成，根據(jù)估計，僅有0．1%的CTCs會形成轉(zhuǎn)移灶［4］。由于CTCs的檢測技術(shù)沒有取得突破性進展，所以其檢測并未在腫瘤的防治中發(fā)揮應(yīng)有的作用。隨著CTCs檢測技術(shù)的不斷成熟，美國FDA于2014年批準(zhǔn)了 BioTNT公司的Cellsearch系統(tǒng)在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、乳腺癌和前列腺癌中的應(yīng)用。由于相當(dāng)一部分腫瘤患者術(shù)前已經(jīng)出現(xiàn)腫瘤微轉(zhuǎn)移灶，但常規(guī)傳統(tǒng)的影像學(xué)檢查無法發(fā)現(xiàn)，CTCs檢測有助于發(fā)現(xiàn)早期患者的微轉(zhuǎn)移灶，Sastre等［5］發(fā)現(xiàn)CTCs與直結(jié)腸癌的臨床分期相關(guān)，且能在早期的直結(jié)腸癌患者體內(nèi)檢測到，提示檢測CTCs有助于早期發(fā)現(xiàn)腫瘤。由于CTCs在外周血中數(shù)量較少，所以從血液中分離富集CTCs是進行檢測的關(guān)鍵。目前用于CTCs的富集的方法主要有：梯度離心法、過濾法、免疫磁珠分選法。檢測方法主要有免疫細胞化學(xué)法、流式細胞檢測法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)核酸擴增法、光纖陣列掃描術(shù)、酶聯(lián)免疫斑點術(shù)、CTC芯片技術(shù)等。

該研究采用免疫磁珠陰性富集法進行富集，通過去除血漿，裂解紅細胞，利用表面包被磁珠的抗白細胞共同抗原的抗體去除白細胞，從而富集得到稀有細胞，最后進行免疫熒光染色在熒光顯微鏡下進行鑒定判讀。CTCs檢測有助于TNM分期［6］，但也有學(xué)者認為與TNM分期無關(guān)，而與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)密切相關(guān)［7］。本組60例應(yīng)用上述方法檢測胃癌根治術(shù)患者外周血中CTCs陽性率為43．3%，Ⅲ期患者陽性率高于Ⅰ期、Ⅱ期 （P＜0．01），提示與腫瘤TNM分期密切相關(guān)。CTCs陽性患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移機率明顯增加，CTCs陽性患者轉(zhuǎn)移率Ⅲ期高于Ⅱ期和Ⅰ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01），分期越晚，CTCs陽性患者遠處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險更高，說明CTCs檢出與胃癌的預(yù)后密切相關(guān)。因此對于原發(fā)性胃癌CTCs檢測對于早期預(yù)測轉(zhuǎn)移，TNM分期及預(yù)后評價具有重要意義。檢測CTCs可早于常規(guī)影像學(xué)檢查評估腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險，判斷患者預(yù)后，指導(dǎo)術(shù)后輔助化療和腫瘤的個體化治療。這對于降低術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率，提高生存率具有重要的意義。

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［6］黃選章，王振寧．循環(huán)腫瘤細胞對胃癌臨床病理特點和預(yù)后意義的Meta分析［C］．第9屆全國胃癌學(xué)術(shù)會議暨第二屆陽光長城腫瘤學(xué)術(shù)會議論文集，2014：6．

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［2015-09-14收稿，2015-10-12修回］ ［本文編輯：吳 蓉］

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10．14172/j．issn1671-4008．2016．03．022

250031山東濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院腫瘤科（狄劍士，鄭桂麗，李鍇男，王寶成）；264000山東煙臺，解放軍71146部隊煙臺第一干休所衛(wèi)生所（李夢巖）