段琳琳， 李紅梅， 何 海

上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 楊浦 200093

響應面-滿意度函數(shù)優(yōu)化重組大腸桿菌產(chǎn)NMN
轉(zhuǎn)移酶發(fā)酵條件

段琳琳， 李紅梅*， 何 海

上海理工大學醫(yī)療器械與食品學院，上海 楊浦 200093

重組大腸桿菌Escherichaiacoli能高效表達NMN轉(zhuǎn)移酶, 以此為出發(fā)菌株，以菌體生長量OD600和NMN轉(zhuǎn)移酶的活力為響應值，對重組大腸桿菌產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶的發(fā)酵條件進行優(yōu)化。首先以Plackett-Burman實驗設計優(yōu)化篩選出3個主要影響因子：胰蛋白胨、甘油、MgSO4；隨后以Box-Behnken中心組合設計建立上述3個因子對OD600和NMN轉(zhuǎn)移酶活力水平的數(shù)學模型；最后通過滿意度函數(shù)獲得最佳發(fā)酵條件為：酵母粉30 g/L，胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，K2HPO440.5 g/L，KH2PO46.0 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.6 g/L，接種量1.5%，誘導時間12 h。在該優(yōu)化條件下，菌體生長和產(chǎn)酶水平均獲得了顯著的提升。重組NMN轉(zhuǎn)移酶的活力水平從8.85 U/mg提高到15.48 U/mg，菌體生長量OD600從4.85提高到6.01，提高幅度分別為74.92%和23.92%。

NMN轉(zhuǎn)移酶； 發(fā)酵優(yōu)化； 滿意度函數(shù)； 響應面法

NMN轉(zhuǎn)移酶(Nmnat)作為生物體內(nèi)唯一一種能催化合成NAD的生物酶，對于維持體內(nèi)NAD水平至關(guān)重要[1]。研究發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)適量的表達Nmnat也可以使非本體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)固，從而減少蛋白質(zhì)聚合和損傷，并且可以清理毒性蛋白以減少蛋白質(zhì)水解應激反應的發(fā)生。作為生物體內(nèi)重要的“管家酶”，NMN轉(zhuǎn)移酶在糖代謝、基因調(diào)控和腫瘤細胞治療方面起到重要作用[2-3]。例如Nagase研究發(fā)現(xiàn)人類大腦中的Nmnat可延緩海馬組織中與學習和記憶相關(guān)功能的衰退[4]。Nmnat還能使抗腫瘤藥物6-巰基嘌呤在生物體內(nèi)轉(zhuǎn)化為ATP類似物，從而抑制NAD的合成，使細胞內(nèi)NAD衰竭，最終導致癌細胞死亡[5]。

本課題組已成功構(gòu)建出產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌，并對其酶學性質(zhì)及熱穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)研究。為提高該工程菌的產(chǎn)酶水平，對該菌的培養(yǎng)基配方和發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。目前，響應面分析法是一種常見的培養(yǎng)基優(yōu)化方法，它可以將體系目標響應值作為一個或多個因子的函數(shù)，精確研究因子與響應值之間的關(guān)系，從而確定多因子系統(tǒng)的最優(yōu)發(fā)酵條件[6-7]。然而響應面法在多響應值優(yōu)化中存在一定的局限性，難以尋求各響應值之間的均衡。為了合理、客觀的進行多響應值之間的分析評價，Derringer等提出滿意度函數(shù)法[8]，即通過特定的滿意度函數(shù)將各響應值轉(zhuǎn)化為0到1之間的數(shù)，實現(xiàn)多響應值向單響應值的轉(zhuǎn)化，可以使各個響應值保持均衡并在某種意義上達到總體最優(yōu)[9-10]。目前，響應面結(jié)合滿意度函數(shù)法在微生物產(chǎn)酶條件優(yōu)化的應用還較為少見。本研究采用響應面法結(jié)合滿意度函數(shù)優(yōu)化重組大腸桿菌發(fā)酵產(chǎn)NMN轉(zhuǎn)移酶條件，旨在尋求菌體量與產(chǎn)酶能力的最佳組合，為后續(xù)的發(fā)酵放大試驗提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliBL21(DE3)由實驗室保存。質(zhì)粒載體pET30α(+)購自TaKaRa公司。E.coliBL21(DE3)pET30α(+)-Nmnat重組大腸桿菌由本實驗室構(gòu)建。異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購自上海生工生物工程公司。酵母粉購自湖北安琪酵母股份有限公司。蛋白胨購自上海緣肽生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基采用 LB 培養(yǎng)基(g/L): 胰蛋白胨 10.0，酵母膏 5.0，NaCl 10.0。

磷酸鹽緩沖溶液(g/L): KH2PO423.1 g，K2HPO4125.4 g，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基采用TB培養(yǎng)基:胰蛋白胨12 g/L，酵母粉24 g/L，甘油4 mL/L，121 ℃滅菌20 min，待冷卻至60 ℃后按體積比9∶1加入上述磷酸鹽緩沖溶液。

固體培養(yǎng)基中瓊脂添加量2%。培養(yǎng)基中均需添加終濃度為30 μg/mL的硫酸卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

將確定重組成功表達的陽性單菌落pET30α(+)-Nmnat的單菌落接種于10 mL滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，在37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)(8 h～12 h)，即為種子液。

1.2.2 發(fā)酵及產(chǎn)酶方法

種子液以1%接種量接入含卡那霉素抗性的100 mL TB液體培養(yǎng)基，當培養(yǎng)至OD600為0.5～0.7時，加入IPTG至終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃，180 r/min誘導表達一定時間后，離心收集菌體。離心后的菌體用50 mmol/L 的磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5)重懸，超聲破碎菌體(功率300 W，超聲4 s，間隔6 s，超聲60次)。破壁后菌液于4 ℃，12 000 r/min離心20 min，收集上清液備用。

1.2.3 NMN轉(zhuǎn)移酶活力的測定

反應體系: 1 mol/L pH 7.5 Tris-HCl緩沖液，300 mmol/L NMN，50 mmol/L ATP，50 mmol/L Mn2+，乙醇2%，一定量的粗酶液，7U的ADH(乙醇脫氫酶)，混勻。置37 ℃恒溫水浴中振蕩反應2 h，加入0.155 mol/L的EDTA反應5 min，終止酶反應，反應液冰浴冷卻，8 000 r/min離心1 min，取上清液并在340 nm處測定反應產(chǎn)物的吸光值OD340，計算Nmnat活力。酶活力計算公式如下：

(公式1)

其中，EW為OD340，V為反應體系的體積，mL;l為光程的距離，cm；蛋白質(zhì)含量測定采用Bradford法。

酶活定義為：在37 ℃，1 mL反應體系中，每分鐘催化得到1 μmol NMN的酶量為1 U。

1.2.4 Plackett-Burman實驗設計

當影響因素較多時通常選用Plackett-Burman試驗設計篩選顯著因子[11]。選取酵母粉、胰蛋白胨、甘油、MgSO4、NH4Cl、NaCl、KH2PO4、K2HPO4、接種量、誘導時間作為PB設計的10個因素，每因素取2水平，高水平為低水平的1.5倍。為減少實驗誤差，等間距引進3個虛擬因子，分別為X4、X8、X12。通過比較各因素的顯著水平，篩選出對菌體的生長量和酶活力影響顯著的因子，采用Minitab 15.0設計PB試驗序，進行試驗分析，各因素及水平值見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計

1.2.5 最陡爬坡法的試驗設計

分別以菌體生長量OD600和Nmnat活力為響應值，設計爬坡試驗的方向和梯度，以確定響應面設計的中心點[12]。

1.2.6 Box-Behnken 試驗設計

采用Box-Behnken 試驗設計，以篩選出的3個因子進行優(yōu)化處理，以最陡爬坡試驗中最大響應值所對應的各因素值為響應面設計中心點，用Design Expert 8.0進行試驗設計和分析，具體見下表2。

1.2.7 滿意度函數(shù)

發(fā)酵過程中，微生物菌體量的增長和產(chǎn)酶水平提高之間不一定呈線性關(guān)系，故采用滿意度函數(shù)法將多個響應值轉(zhuǎn)化成單響應值優(yōu)化，以期獲得總體最優(yōu)。滿意度函數(shù)的平衡尺度d的范圍為0～1，d=0說明響應值嚴重偏離目標值，d=1說明響應值與目標值接近。大腸桿菌的生長量OD600和Nmnat的活力都屬于望大特性，其滿意度函數(shù)定義為[13]：

表2 采用Box-Behnken 試驗設計因素水平及編碼

(公式2)

(公式3)

2 結(jié)果與分析

2.1 NMN轉(zhuǎn)移酶生物合成模式的研究

按照1.2.2描述的培養(yǎng)方法，將重組大腸桿菌接種到初始培養(yǎng)基中，每隔1 h測OD600和Nmnat的酶活力大小，對大腸桿菌的生長和產(chǎn)Nmnat的生物合成模式進行研究，結(jié)果如圖1所示。

從圖中可以看出，1 h ～8 h是重組大腸桿菌的對數(shù)生長期，8 h后菌體生長進入穩(wěn)定期。在加入誘導劑IPTG前，重組大腸桿菌產(chǎn)Nmnat較少，加入IPTG后，產(chǎn)酶量隨著菌體的生長逐步提高；在菌體生長進入穩(wěn)定期(8 h)后，酶活水平仍在上升，12 h時達到最大值，說明大腸桿菌產(chǎn)Nmnat與菌體生長存在部分耦合的關(guān)系，即Nmnat隨著菌體的生長逐步合成，當菌體生長進入穩(wěn)定期后，仍繼續(xù)合成Nmnat。因此，在后續(xù)的優(yōu)化研究中，需要尋求菌體生長和Nmnat的活力均衡以獲得總體最優(yōu)。

圖1 重組大腸桿菌的菌體量增長與Nmnat酶活力間的關(guān)系

2.2 Plackett-Burman設計及結(jié)果分析

PB實驗設計及結(jié)果見表3，以Nmnat活力和菌體生長量OD600為響應值的方差和顯著性分析見表4和表5。一般P<0.05時，相應因素為顯著影響因子[13]。根據(jù)表4可知，以Nmnat酶活為響應值時，甘油和MgSO4為顯著影響因子，均為負效應；同理，根據(jù)表5，以菌體生長OD600為響應值時，胰蛋白胨和MgSO4為顯著影響因子，其中胰蛋白胨為正效應，MgSO4為負效應。因此，在TB培養(yǎng)基的基礎上，適當減小甘油和MgSO4的濃度有益于重組Nmnat的表達，而適當增加胰蛋白胨濃度，減小MgSO4濃度則有利于大腸桿菌的生長，其它因素影響效果不顯著。因此，選擇胰蛋白胨、甘油和MgSO4作為后續(xù)最陡爬坡實驗和中心組合實驗設計的顯著影響因素。

2.3 最陡爬坡法試驗結(jié)果分析

根據(jù)PB試驗設計結(jié)果，通過增加胰蛋白胨、減小甘油和MgSO4濃度可提高產(chǎn)Nmnat能力和菌體的生長量，其它因素則遵循正效應取較高值，負效應取較低值的原則進行取值。結(jié)果如表6所示：利用4號培養(yǎng)基進行發(fā)酵生產(chǎn)獲得的Nmnat比活和菌體生長量OD600均最大。從4號開始，Nmnat比活和OD600均降低，說明培養(yǎng)基中適量的氮源，碳源和硫酸鹽有助于Nmnat的重組表達和菌體生長，因此選用4號培養(yǎng)基為Box-Behnken 實驗設計的中心點。

表3 PB實驗設計及結(jié)果

表4 以Nmnat為響應值的PB設計方差及顯著性分析

注：*表示差異顯著(P<0.05)

表5 以OD600為響應值的PB設計方差及顯著性分析

表6 最陡爬坡實驗設計及結(jié)果

2.4 Box-Behnken 試驗結(jié)果方差分析及滿意度分析

Box-Behnken 實驗設計與結(jié)果分析見表7，利用Design Expert 8.0對數(shù)據(jù)進行分析和多元回歸擬合，建立以Nmnat活力、OD600和總體滿意度D為目標函數(shù)的二次回歸方程，并對回歸方程進行方差分析和顯著性檢驗(表8～10)。

總體滿意度函數(shù)：根據(jù)Box-Behnken試驗設計結(jié)果，取公式(2)中Y1,min=10.5,Y1,max=15.0；Y2,min=4.7,Y2,max=6.1

以Nmnat酶活為響應值的滿意度函數(shù)為：

(公式4)

以OD600為響應值的滿意度函數(shù)為：

(公式5)

D=d1(Y1)0.7×d2(Y2)0.3

(公式6)

表7 Box-Behnken 試驗設計及結(jié)果

2.4.1 以Nmnat酶活為響應值的方差分析

Nmnat活力(Y1) 與胰蛋白胨(X2)、甘油(X3)和MgSO4(X5)的二次多項回歸方程如下所示：

Y1=35.104-4.496X2+ 0.394X3+15.593X5-0.043X2X3+0.455X2X5+1.893X3X5+ 0.202 X22-0.154 X32-52.615X52

表8方差分析顯示，該回歸模型顯著(P<0.05)，說明酶活力與各個變量之間存在顯著的線性相關(guān)，失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著(P=0.465>0.05)，即方程失擬度較小，可以利用模型預測響應值Nmnat與變量之間的關(guān)系。其中，一次項X2、X3、X5都不顯著，說明單一的各因素對NMN轉(zhuǎn)移酶比活沒有顯著影響；交叉項X2X3顯著，X2X5和X3X5不顯著，說明X2(胰蛋白胨)和X3(甘油)對Nmnat比活有顯著交叉影響；二次項X22、X32顯著。

表8 以Nmnat酶活為響應值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗

注：R2= 90.4%(調(diào)整R2= 70.76%)

2.4.2 以OD600為響應值的方差分析

OD600(Y2)與胰蛋白胨(X2)、甘油(X3)和MgSO4(X5)的二次多項回歸方程如下所示：

表9方差分析顯示，該回歸模型極顯著(P=0.008<0.01)，說明響應值OD600與各個變量之間存在極顯著的線性關(guān)系；失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著(P=0.962>0.05)，說明方程在回歸模型的擬合度好，可以實際預測響應值(OD600)與變量之間的關(guān)系。其中，一次項X3顯著(P<0.05)，說明甘油濃度對OD600有顯著影響；交叉項X2X3顯著，X2X5和X3X5不顯著，說明X2(胰蛋白胨)和X3(甘油)對OD600有顯著交叉影響；二次項X32顯著，X22和X52不顯著。

表9 以OD600為響應值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗

R2=84.8%(調(diào)整R2=72.13%)

2.4.3 以總體滿意度D為響應值的方差分析

以總體滿意度D為響應值的方差分析如表10所示，該模型顯著(P<0.05)，說明方程在響應值與變量之間存在顯著的線性關(guān)系；失擬性在置信區(qū)間95%水平上不顯著(P=0.574 > 0.05)，即失擬度較小，實驗誤差在可接受范圍之內(nèi)，說明該模型可以用于預測總體滿意度與變量之間的情況。多響應值轉(zhuǎn)化為單響應值即總體滿意度D，利用響應面法求解D，得到理論最大總體滿意度為1.028，此時對應的理論最優(yōu)發(fā)酵條件為胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，相應的理論Nmnat酶活為15.48 U/mg，OD600為6.04。由表7可知，以Nmnat酶活最大響應值14.84 U/mg所對應的菌體生長量OD600為5.62進行滿意度計算，此時滿意度D1為1.026；而以菌體生長量OD600最大響應值6.02所對應的Nmnat酶活為12.79 U/mg進行滿意度計算，滿意度D2為0.729，均低于理論最大總體滿意度1.208。這說明滿意度函數(shù)法能合理在多響應值之間取得均衡，適用于多響應值的優(yōu)化。

表10 以總體滿意度D為響應值的回歸方程方差分析及顯著性檢驗

2.5 最佳條件的驗證試驗

為檢驗響應曲面法和滿意度函數(shù)法所得結(jié)果的可靠性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件，進行3次平行試驗，結(jié)果測得Nmnat比活為(15.45±0.02) U/mg，OD600為6.01±0.03，與預測值基本一致，說明通過上述實驗方法得到的最優(yōu)發(fā)酵條件是可靠的，具有一定參考價值。

3 結(jié)論

本研究利用數(shù)學統(tǒng)計方法，將響應面與滿意度函數(shù)相結(jié)合，對重組大腸桿菌產(chǎn)Nmnat的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，結(jié)果如下：

(1)PB實驗設計結(jié)果顯示，在初始TB培養(yǎng)基的基礎上，適當增加胰蛋白胨濃度，減小MgSO4的濃度，對重組大腸桿菌產(chǎn)Nmnat以及菌體的生長有一定的促進作用。

(2)通過滿意度函數(shù)法將多響應值化問題轉(zhuǎn)化為單響應變量優(yōu)化，獲得總體最優(yōu)，所得最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基為酵母粉30 g/L，胰蛋白胨10.5 g/L，甘油3.49 mL/L，MgSO40.45 g/L，K2HPO440.5 g/L，KH2PO46.0 g/L，NH4Cl 1.5 g/L，NaCl 0.6 g/L，接種量1.5%，誘導培養(yǎng)時間12 h。在該優(yōu)化條件下，菌體生長量OD600為6.01，Nmnat酶活由8.85 U/mg提高到15.48 U/mg，提高幅度達74.92%。運用響應面與滿意度函數(shù)相結(jié)合的優(yōu)化方法顯著提高了該重組大腸桿菌的產(chǎn)酶水平，同時為多響應值的發(fā)酵優(yōu)化提供了參考。

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Optimization of NMN adenylyltransferase production by recombinant Escherichia coli using response surface methodology coupled with desirability function

DUAN Lin-lin, LI Hong-mei, HE Hai

University of Shanghai for Science and Technology, School of Medical Instrument and Food Engineering,Yangpu 200093,Shanghai，China

The fermentation conditions of NMN adenylyltransferase production by recombinantEscherichiacoliwere optimized. Biomass yield (OD600) and NMN adenylyltransferase activity were selected as response value during fermentation condition optimization. Peptone, glycerin and MgSO4were screened to be the three key components using Plackett-Burman design method. Then, the mathematical model reflecting the three main factors and the production level of enzyme was established by using the Box-Behnken design method. Finally, a satisfactory degree function was defined and the satisfactory solution was obtained. The final optimal fermentation conditions were: yeast extract 30 g/L, peptone 10.5 g/L, glycerol 3.49 mL/L, MgSO40.45 g/L, K2HPO440.5 g/L, KH2PO46.0 g/L, NH4Cl 1.5 g/L, NaCl 0.6 g/L, inoculum size of 1.5% and induction time of 12 h. After the validated experiment under above conditions, enzyme production and biomass of recombinant strain were increased by 74.92% and 23.92%, respectively.

NMN adenylyltransferase; fermentation optimization; desirability function; response surface methodology

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.008

段琳琳(1990～)，女，碩士研究生。研究方向：微生物資源利用。E-mail:duanlinlin0303@163.com。

*通信作者: 李紅梅，博士，碩士生導師。Tel：021-55271117，E-mail: sunnysand@126.com。