孫明雪, 周景文

江南大學(xué)生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122

釀酒酵母合成異源單萜類化合物的研究進展

孫明雪, 周景文*

江南大學(xué)生物工程學(xué)院， 江蘇 無錫 214122

單萜類化合物在食品、醫(yī)藥和工業(yè)等領(lǐng)域有重要的應(yīng)用，具有可觀的經(jīng)濟價值。隨著合成生物學(xué)的日益發(fā)展，利用微生物作為細胞工廠合成單萜類化合物成為時下的研究熱點。釀酒酵母是真核生物表達的模式菌株，其甲羥戊酸途徑為單萜類化合物的合成提供直接前體，因此在釀酒酵母中構(gòu)建異源單萜類化合物合成途徑有較大優(yōu)勢。本文介紹了釀酒酵母細胞中異源單萜類化合物合成途徑的構(gòu)建。從甲羥戊酸途徑代謝通量調(diào)控機制和融合酶調(diào)控酶催化反應(yīng)效率兩方面概述了釀酒酵母異源合成單萜類化合物的研究進展。

釀酒酵母； 甲羥戊酸途徑； 單萜類化合物； 代謝； 融合酶

萜類化合物是自然界中廣泛存在的次級代謝產(chǎn)物，其種類多樣且數(shù)量巨大，迄今人們已發(fā)現(xiàn)40 000多種[1]。其中單萜類化合物廣泛應(yīng)用在食品、醫(yī)藥和化妝品等工業(yè)領(lǐng)域，具有重要的經(jīng)濟價值[2, 3]。目前，單萜類化合物主要從自然資源中提取，產(chǎn)量低且成本高，易受自然因素和外部環(huán)境的影響?；瘜W(xué)合成面臨工序繁多且分離困難等一些問題，且該方法較難實現(xiàn)化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜及有特定親和性和專一性的萜類化合物的合成[4]。因此，單萜類化合物的工業(yè)化生產(chǎn)需要更可取的合成方式。近年來，微生物細胞工廠的建立和發(fā)展，為單萜類化合物的異源合成提供可能性[5, 6]。釀酒酵母作為真核生物表達的模式菌株，常被用于表達動植物來源基因[7]。因此，釀酒酵母也被用作單萜類化合物異源合成的表達宿主。釀酒酵母自身不具有合成單萜類化合物的能力，但其甲羥戊酸代謝途徑能夠提供單萜類合成的前體物質(zhì),為單萜類化合物合成創(chuàng)造有利條件[8]。目前，釀酒酵母異源合成單萜類化合物產(chǎn)量仍然較低，對單萜類化合物代謝途徑和調(diào)控機理的深入研究將進一步促進單萜類化合物的高效合成。

1 釀酒酵母單萜類化合物異源合成途徑的構(gòu)建

1.1 釀酒酵母甲羥戊酸合成途徑

釀酒酵母甲羥戊酸(MVA)代謝途徑(圖1)首先由乙酰輔酶A(Acetyl-CoA)經(jīng)縮合反應(yīng)生成3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA (HMG-CoA)，然后在HMG-CoA還原酶(HMGR)的作用下由HMG-CoA合成MVA，MVA經(jīng)焦磷酸化和脫羧作用生成異戊烯焦磷酸(IPP)，IPP在異構(gòu)化酶的作用下生成二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)。DMAPP和IPP經(jīng)過縮合反應(yīng)形成香葉基二磷酸(GPP)，即合成單萜的前體；GPP又進一步與IPP結(jié)合，生成法尼基焦磷酸(FPP)，即合成倍半萜的前體；FPP再與另一個IPP縮合，形成香葉酰香葉基二磷酸(GGPP)，即合成二萜的前體。在多種酶催化作用下，以GPP、FPP、GGPP為前體，合成種類多樣的類異戊二烯化合物。

1.2 單萜類化合物合成途徑的構(gòu)建

與植物細胞相比，釀酒酵母細胞內(nèi)缺乏單萜類合成酶，因此不具有合成單萜類化合物的能力。為了實現(xiàn)釀酒酵母細胞表達異源單萜類化合物，需引入外源單萜合成酶。這些編碼單萜類合成酶基因大多數(shù)來源于植物。1996年，Dudareva等從植物仙女扇中獲得第一個單萜合成酶編碼基因，主要負責合成芳樟醇合成酶(LIS)[9]。2010年，Chen等從植物獼猴桃(Actinidiaarguta,Actinidiapolygama)中分離得到兩種單萜合成酶，AaLS1和ApLS1，合成(S)-芳樟醇[10]。

圖1 釀酒酵母中甲羥戊酸代謝途徑

目前，少數(shù)來源于植物的單萜合成酶已經(jīng)實現(xiàn)在釀酒酵母中的表達。Oswald等在釀酒酵母中成功表達來源于山字山草(Clarkiabreweri)的芳樟醇合成酶和來源于甜羅勒(Ocimunbasilicum)的香葉醇合成酶，并通過代謝工程手段進一步提高了單萜芳樟醇和香葉醇合成能力[11]。2008年，Herrero等在野生型釀酒酵母的類異戊二烯生物合成途徑上成功引入芳樟醇合成代謝支路，并且能夠有效分泌芳樟醇[12]。表明利用釀酒酵母作為細胞工廠高效合成單萜類化合物有極大生產(chǎn)潛力。

2 調(diào)控釀酒酵母甲羥戊酸途徑代謝通量

釀酒酵母甲羥戊酸代謝途徑代謝通量較低，且調(diào)控機制復(fù)雜，很大程度影響單萜合成產(chǎn)量。為了增加甲羥戊酸途徑的代謝通量，通過對諸多重要調(diào)控節(jié)點的控制，達到改變基因轉(zhuǎn)錄水平、mRNA的翻譯、酶活及蛋白穩(wěn)定性的目的，從而調(diào)節(jié)整個途徑的代謝通量。

2.1 關(guān)鍵酶的調(diào)控機制

HMGR是甾醇合成途徑中的限速酶，該酶催化HMG-CoA不可逆的生成MVA。在釀酒酵母中，HMGR有兩種同工酶，Hmg1p蛋白比較穩(wěn)定，Hmg2p蛋白則經(jīng)過固醇合成途徑降解[13]。受細胞調(diào)控機制影響，末端代謝產(chǎn)物的積累抑制HMGR的酶活，為了解除抑制作用，將HMGR的N末端膜錨定區(qū)域截斷，單獨表達具有催化作用的蛋白C末端(tHMGR)[14, 15]。Rico等在釀酒酵母中過量表達tHMG1，使單萜產(chǎn)量提高至原來的2倍[16]。Behrendorff等利用一株表達tHMG1基因的釀酒酵母合成檸檬烯，使其產(chǎn)量提高至1.5 mg/L[17]。劉繼棟等過量表達tHMG1基因顯著提高香葉醇產(chǎn)量[18]。表明HMGR是釀酒酵母甲羥戊酸途徑上關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點，tHMGR是該酶的調(diào)控形式，對增加甲羥戊酸途徑代謝通量有顯著作用。

異戊二烯焦磷酸異構(gòu)酶(IDI1) 是控制所有萜類化合物合成的第一步，在IPP到DMAPP轉(zhuǎn)化過程中能夠調(diào)節(jié)IPP/DMAPP的存在比例[19, 20]。2011年，Ignea等為了增加萜類生產(chǎn)量，通過基因工程手段調(diào)控IDI1表達，最終提高單萜產(chǎn)量，并且維持菌株的穩(wěn)健性。然后將IDI1與HMG2 (K6R)同時進行共表達，實現(xiàn)單萜合成最大產(chǎn)量[21]。2014年，Ignea等在釀酒酵母中過量表達IDI1，使檜烯產(chǎn)量提高3倍[22]。表明通過過量表達IDI1可以將平衡轉(zhuǎn)向GPP合成有利的方向，增加前體物質(zhì)積累，有利于單萜類物質(zhì)的合成。

2.2 強化單萜合成前體物質(zhì)GPP供給

在釀酒細胞中，法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)首先將一分子DMAPP與一分子IPP進行縮合反應(yīng)，形成GPP，然后GPP與一分子IPP進行縮合，生成FPP。GPP與FPP的合成共用一個由ERG20基因編碼的FPPS，通常GPP與FPPS的催化位點緊密結(jié)合并直接轉(zhuǎn)化為FPP，使游離存在的GPP含量極少，造成單萜合成前體物質(zhì)供應(yīng)不足，較大程度限制單萜類化合物的合成。

通過序列比對分析來源于不同生物體內(nèi)的FPPS發(fā)現(xiàn)，在該酶的保守區(qū)域包含兩段Asp-rich序列。第一個Asp-rich序列為DDXXD或DDXXXXD，主要通過催化反應(yīng)綁定DMAPP，GPP，F(xiàn)PP。第二個序列DDXXD主要負責綁定IPP。研究表明，通過對FPPS保守區(qū)域特定位點進行定點突變，可以使GPP從FPPS上的結(jié)合位點釋放，從而增加細胞內(nèi)游離GPP含量[23]。Fischer等對釀酒酵母ERG20基因保守區(qū)域特定催化位點K197進行突變，并在該突變菌株內(nèi)表達異源香葉醇合成酶，最終顯著提高單萜香葉醇合成產(chǎn)量[24]。表明對ERG20基因的調(diào)控能夠調(diào)整GPP和FPP的合成比例，使GPP合成量增加。

3 構(gòu)建融合酶調(diào)控酶催化反應(yīng)效率

3.1 融合酶的空間靠近效應(yīng)

融合酶是指采用分子生物學(xué)手段，利用融合酶技術(shù)，將目標酶與另外一個或多個酶以一定的形式連接起來，從而獲得的具有多種功能的酶[25]。通過融合酶的構(gòu)建，可以將參與順序酶催化過程的兩個(或多個)酶催化活性整合在一個雜合蛋白上，從而實現(xiàn)多酶的空間靠近效應(yīng)，改變酶分子的空間組織結(jié)構(gòu)，進一步控制酶催化反應(yīng)效率。

在合成代謝途徑上，各個酶的空間位置結(jié)構(gòu)對中間產(chǎn)物的流向起重要影響，特別是以下幾種情況：中間產(chǎn)物有其他競爭反應(yīng)；中間產(chǎn)物易失活；中間產(chǎn)物對細胞產(chǎn)生毒性或者對酶存在反饋抑制；其他非目的底物對酶有競爭[26, 27]。在多步代謝反應(yīng)途徑中，前體物質(zhì)作為中間產(chǎn)物可能會擴散，被降解或者被其他競爭途徑上的酶利用合成其他物質(zhì)，中間產(chǎn)物的消耗會直接影響萜類化合物的合成效率。融合酶的空間靠近效應(yīng)能夠拉近合成途徑中的兩個(或多個)酶的空間距離，促進中間產(chǎn)物在兩個酶催化活性位點的直接傳遞，減少中間產(chǎn)物的擴散和降解，同時防止中間產(chǎn)物被競爭利用，防止酶活性位點被其他非目的底物所占據(jù)，因此可以有效的提高產(chǎn)物的產(chǎn)量、產(chǎn)率和底物的轉(zhuǎn)化率[28, 29]。

3.2 構(gòu)建融合酶

在釀酒酵母細胞中引入異源單萜合成酶，該酶能否在宿主細胞中正確表達受到各方面因素的影響，并且異源單萜合成酶需要利用宿主細胞自身的酶代謝系統(tǒng)合成的代謝中間體合成目標產(chǎn)物。當異源酶導(dǎo)入宿主細胞中，酶分子之間的距離難以控制，制約異源酶的催化效率[25]。

在釀酒酵母中，異源單萜合成酶利用前體物質(zhì)GPP合成單萜類化合物，F(xiàn)PPS催化GPP的合成，因此將參與序列催化反應(yīng)的單萜合成酶與FPPS連接，構(gòu)建一個融合酶。在融合酶構(gòu)建過程中，引入連接肽，將兩個酶間距適當隔開，避免兩酶不同結(jié)構(gòu)域在折疊、催化過程中相互干擾[30, 31]。兩酶結(jié)構(gòu)域的N端和C端的連接方式同樣會影響融合酶功能的表達。研究表明，融合表達LIS和FPPS，與單獨表達LIS相比，融合表達使(S)-芳樟醇產(chǎn)量提高近70%[32]。說明多步代謝反應(yīng)體系中，調(diào)節(jié)順序酶活性中心的空間位置結(jié)構(gòu)對底物的傳遞至關(guān)重要。

4 結(jié)論與展望

隨著對單萜類代謝途徑及其調(diào)控機制研究的深入，代謝工程成為實現(xiàn)釀酒酵母異源合成單萜類化合物最具潛力的方法之一[33, 34]。目前，很多研究已經(jīng)通過代謝工程手段實現(xiàn)單萜類化合物在釀酒酵母中的異源合成。但合成產(chǎn)量普遍較低，要實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)還有很多工作需要完善。近年來合成生物學(xué)的快速發(fā)展，為利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)單萜類化合物奠定了基礎(chǔ)。

釀酒酵母甲羥戊酸途徑提供單萜類化合物合成的直接前體物質(zhì)，同時也為細胞提供必要的初級代謝產(chǎn)物，目前對該途徑的代謝調(diào)控機制尚不完全清楚，限制了異源單萜類化合物代謝途徑的構(gòu)建。因此，對復(fù)雜調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)的持續(xù)研究將會有利于宿主細胞代謝途徑的重新設(shè)計和優(yōu)化，相關(guān)代謝數(shù)據(jù)庫的建立，產(chǎn)物合成途徑的不斷挖掘，從而獲得高效微生物細胞工廠。更多基因組的開發(fā)和測序研究，將加速新化合物的發(fā)現(xiàn)。在微生物細胞中構(gòu)建單萜類化合物合成途徑過程中，異源單萜類合成酶能否在宿主細胞中正確表達有眾多影響因素。因此，酶工程的發(fā)展也能夠為異源合成途徑的建立提供基礎(chǔ)。綜合利用以上方法，最終將會實現(xiàn)單萜類化合物在釀酒酵母中的工業(yè)化生產(chǎn)。

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Research advances of heterologous synthesis of monoterpenes in Saccharomyces cerevisiae

SUN Ming-xue， ZHOU Jing-wen

School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122 Jiangsu, China

Monoterpenes are widely used in food, medicine and industries, which have great economical values. With the development of synthetic biology, monoterpenes synthesis using microbial cell as factory have become a hot research topic.Saccharomycescerevisiaeis a model eukaryotic expression strain, mevalonate pathway provides precursors for the synthesis of monoterpenes, so it has great advantages to construct heterologous monoterpenes synthesis pathway. The construction of heterologous monoterpenes synthesis pathway inSaccharomycescerevisiaewas introduced. The research advances in heterologous expression of monoterpenes inSaccharomycescerevisiaewere reviewed from regulatory mechanisms of metabolic flux of mevalonate pathway and regulation of enzyme catalytic efficiency using fusion enzymes.

Saccharomycescerevisiae; mevalonate pathway; monoterpenes; metabolism; fusion enzymes

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.06.009

國家自然科學(xué)基金重點項目(31130043)，國家自然科學(xué)基金(31000807)，江蘇省自然科學(xué)基金重點項目(BK2011004)，江蘇省自然科學(xué)基金(BK2010150)。

孫明雪(1987～)，女，碩士，助理實驗師。Tel：0510-85918125，E-mail:mingxuesun@163.com。

*通信作者: 周景文(1982～)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。Tel：0510-85918312，E-mail：zhoujw1982@jiangnan.edu.cn。