■韓東魁 高 凱 張 敏* 陳石婷 國(guó)傳福

（1.延邊大學(xué)，吉林延吉133000；2.琿春市龍?jiān)＾r(nóng)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司，吉林琿春133300）

1886年，鍺元素被德國(guó)化學(xué)家發(fā)現(xiàn)。一百多年來，科研工作者對(duì)鍺元素進(jìn)行了大量探索性的研究，合成的主要化合物類有鍺的氧化物、硫化物、鹵代物等，為鍺在醫(yī)藥、食品、工業(yè)等方面的廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[1]。鍺有兩種存在形式即有機(jī)鍺和無機(jī)鍺。無機(jī)鍺被動(dòng)物和人類攝入之后是有毒的，并且會(huì)在體內(nèi)蓄積，對(duì)動(dòng)物和人體是有害的。有機(jī)鍺最顯著的功能是抗癌作用。有機(jī)鍺對(duì)多種癌細(xì)胞都有抑制作用，并且可以增強(qiáng)動(dòng)物和人類的免疫功能；對(duì)于人類而言，有機(jī)鍺具有美容養(yǎng)顏，延緩衰老，對(duì)預(yù)防感冒，骨質(zhì)松軟，促進(jìn)血液循環(huán)都有著很好的療效[2]。

硒元素于1973年被正式列入人體必需微量元素。它與動(dòng)物體和人體的各種生理機(jī)能有著密切的聯(lián)系。硒元素與鍺元素相同，分為有無機(jī)硒和有機(jī)硒二種。無機(jī)硒以氧化態(tài)的形式存在，它的毒性高于有機(jī)硒，而吸收率和利用率明顯低于有機(jī)硒。有機(jī)硒以Se2-或者結(jié)合態(tài)形式存在。結(jié)合態(tài)存在的硒可以在體內(nèi)存儲(chǔ)，當(dāng)機(jī)體缺硒時(shí)則通過生理代謝而得到補(bǔ)充。有機(jī)硒與多種疾病的發(fā)生有著密切的關(guān)系，也可以預(yù)防糖尿病、心血管病，以及在某種程度上抑制艾滋病的進(jìn)一步發(fā)展[3]。

米糠安全、綠色、價(jià)格便宜，并且具有降低膽固醇含量，通便，減少尿結(jié)石等諸多營(yíng)養(yǎng)學(xué)作用[4]。本試驗(yàn)以有機(jī)米糠作為富硒富鍺酵母的發(fā)酵底物，不僅可以發(fā)揮出有機(jī)硒和有機(jī)鍺的生物學(xué)特性，而且發(fā)揮了米糠的最大價(jià)值。富硒富鍺有機(jī)米糠作為飼料添加劑，它為動(dòng)物提供了優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)的同時(shí)還可以提高飼料的利用率和適口性[5]。在申小云等[6]的硒鍺對(duì)耗?？寡趸δ艿挠绊懼醒芯勘砻?，當(dāng)硒鍺同時(shí)作為添加劑添加到飼料中的效果明顯高于單一元素作用的效果。本試驗(yàn)使酵母菌同時(shí)富集2種微量元素，這一酵母“雙富”產(chǎn)品開辟了一種新的生物礦物質(zhì)資源，并在養(yǎng)殖業(yè)上具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

金屬耐受性高的酵母菌由本實(shí)驗(yàn)室保存；

固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基（含氯霉素）；

液體酵母菌種子合成基；

米糠發(fā)酵培養(yǎng)基∶營(yíng)養(yǎng)液（葡萄糖∶淀粉∶蒸餾水=1∶1∶50）；

有機(jī)米糠由吉林省琿春市龍?jiān)＾r(nóng)業(yè)發(fā)展集團(tuán)有限公司提供。

1.2 儀器

高壓滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、菌體恒溫培養(yǎng)箱、恒溫干燥箱、紫外可見分光光度計(jì)、電子精密天平、電爐子、計(jì)數(shù)器、分液漏斗、搖床、250 ml錐形瓶（若干）。

1.3 主要試劑

分析純亞硒酸鈉、GeO2純度99%、硝酸、高氯酸、硫酸、雙氧水、甲苯、0.9%NaCl、40%氫氧化鈉溶液、5%氫氧化鈉溶液、2 mol/l甲酸溶液、0.5%3,3-二氨基聯(lián)苯胺溶液（現(xiàn)用現(xiàn)配）、5%EDTA-2Na溶液、1 mol/l NaOH溶液、1 mol/l HCl。

1.4 擴(kuò)大培養(yǎng)液的制作

從實(shí)驗(yàn)室保存的高耐受金屬菌種中，用接菌環(huán)取一環(huán)接種在含有5 ml液體酵母菌種子合成培養(yǎng)基的試管中，30℃、培養(yǎng)18 h。取1 ml上述液體于含有100 ml液體酵母菌種子合成培養(yǎng)基的錐形瓶中，并在錐形瓶的瓶口處蓋上透氣性良好的棉花塞，30℃、200 r/min于搖床中振蕩24 h，作為擴(kuò)大培養(yǎng)液。在米糠發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Na2SeO3和GeO2作為硒源和鍺源，探究不同因素對(duì)酵母菌生成有機(jī)硒和有機(jī)鍺水平的影響。

1.5 酵母菌的計(jì)數(shù)

取發(fā)酵培養(yǎng)后的固液混合物1 g（約1 ml）于10 ml試管中，加入9 ml生理鹽水。并且依次做10倍梯次稀釋，直至生成濃度為10-4g/ml液體，用移液槍吸取50 μl，滴在PDA培養(yǎng)基中，用涂菌棒均勻涂滿整個(gè)培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)結(jié)束后準(zhǔn)確查出酵母菌個(gè)數(shù)。

1.6 有機(jī)硒、有機(jī)鍺生產(chǎn)水平的測(cè)定

目前，有機(jī)微量元素的測(cè)定方法主要通過微量元素的總量與無機(jī)微量元素含量的差值求出[7]。本試驗(yàn)通過分光光度法來間接測(cè)得有機(jī)硒和有機(jī)鍺的含量。

1.6.1 有機(jī)硒含量的測(cè)定

發(fā)酵試驗(yàn)完成后，從培養(yǎng)箱中取出錐形瓶，將其放在無菌操作臺(tái)上，用去離子水反復(fù)洗滌錐形中的沉淀，將濾液置于105℃烘箱中烘干12 h，所得沉淀物反復(fù)研磨成粉末狀，即為酵母干粉，并且準(zhǔn)確記錄所得酵母干粉的重量。

總硒的測(cè)定：取上述所得酵母干粉0.2 g置于燒杯中，加入10 ml消化液（高氯酸∶濃硫酸∶雙氧水=2∶2∶1），加熱至其由淺黃色到透明狀為止，待其冷卻后，用甲酸和NaOH調(diào)節(jié)其pH值至強(qiáng)酸性，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待測(cè)。

無機(jī)硒的測(cè)定：取上述所得酵母干粉0.5 g置于燒杯中，加入蒸餾水25 ml，小火微沸。待其充分溶解后，反復(fù)抽濾燒杯中液體，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待測(cè)。

樣品的測(cè)定：分別將上述處理的樣品分別取10 ml至于分液漏斗中，用甲酸調(diào)節(jié)其至強(qiáng)酸性，加入5 ml 0.2%的EDTA-2Na防止其他離子的干擾，再加入10 ml甲苯萃取分層，將所得混合物搖勻，于避光條件下靜置3 h至分層。將所得有機(jī)層用脫脂棉過濾至比色皿中，在波長(zhǎng)為420 mm下，使用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，即可得總硒含量和無機(jī)硒含量，二者差值即為有機(jī)硒含量[8]。

1.6.2 有機(jī)鍺含量的測(cè)定

總鍺的測(cè)定：取上述所得酵母干粉0.2 g于坩堝中，加入5 ml濃硫酸，在通風(fēng)櫥內(nèi)碳化至無煙為止，碳化完成后小心加入足量的H2O2，將其小火煮至呈透明狀，加入10 ml NaOH溶液，加熱充分溶解上述溶液，再用1 mol/l的硫酸調(diào)節(jié)pH值至微酸性，此時(shí)溶液為透明狀，將所得溶液，移至50 ml容量瓶中，定容，放置待測(cè)。

無機(jī)鍺的測(cè)定：取上述所得酵母干粉0.5 g置于燒杯中，加入蒸餾水25 ml，小火微沸。待其充分溶解后，反復(fù)抽濾燒杯中液體，定容與50 ml容量瓶中待測(cè)。

樣品的測(cè)定：分別移取上述液體置于比色皿中在，505 mm波長(zhǎng)下采用苯芴酮分光光度法測(cè)定吸光值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，可得其總鍺和無機(jī)鍺含量，差值為有機(jī)鍺含量[9]。

有機(jī)微量元素生產(chǎn)水平（mg/l）=酵母菌體有機(jī)微量元素含量（mg/g）×發(fā)酵米糠酵母菌生物量（g/l）。

2 影響酵母菌生產(chǎn)有機(jī)硒和有機(jī)鍺的因素

2.1 酵母菌的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)酵母菌的生長(zhǎng)有著不同的影響。本試驗(yàn)分為6個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間梯度，每個(gè)組中做3個(gè)平行處理，培養(yǎng)時(shí)間依次為24、36、48、60、70 h以及80 h。其它條件各組均為：溫度30.4℃、裝液量60 ml、米糠添加量32 g、接種量8%?？刂茊我蛔兞浚治霾煌慕湍妇囵B(yǎng)時(shí)間對(duì)其含量的影響，從而優(yōu)化其培養(yǎng)條件。

2.2 不同的酵母菌的接種量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同酵母菌的接種量梯度，每組做3個(gè)平行處理，接種量依次為：7%、8%、9%、10%、11%、12%。其它試驗(yàn)條件為：培養(yǎng)時(shí)間60 h、溫度30.4℃、裝液量60 ml、米糠添加量32 g?？刂茊我蛔兞?，分析不同的酵母菌接種量對(duì)富硒、富鍺含量的影響，從而得到最適酵母菌接種量。

2.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

溫度影響著微生物的新陳代謝以及很多重要的生化反應(yīng)，這對(duì)微生物的發(fā)酵以及酵母菌對(duì)硒和鍺的富集能力起著重要的作用。本試驗(yàn)更深一步探究溫度對(duì)富硒富鍺酵母的影響，設(shè)置6個(gè)不同酵母菌溫度梯度，依次為：29.6、29.8、30.0、30.2、30.4、30.6℃。其它試驗(yàn)條件為：培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量10%，裝液量60 ml，米糠添加量32 g?？刂茊我粶囟茸兞?，分析不同培養(yǎng)溫度對(duì)富硒富鍺酵母菌含量的影響。

2.4 不同米糠添加量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同米糠的添加量的梯度，每組做3個(gè)平行處理，米糠添加量依次為：24、28、32、36、40、44 g。其它試驗(yàn)條件為：培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量10%，溫度30.2℃，裝液量60 ml?？刂茊我幻卓诽砑恿繛樽兞?，分析不同米糠添加量對(duì)富硒富鍺酵母菌含量的影響，從而確定本試驗(yàn)最佳米糠添加量。

2.5 不同裝液量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

裝液量的多少直接與發(fā)酵提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)。本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同梯度的裝液量，每組3個(gè)平行處理，裝液量依次為：60、65、70、75、80、85 ml。其它試驗(yàn)條件為：培養(yǎng)時(shí)間60 h，接種量10%，溫度30.2℃，米糠添加量為36 g?？刂茊我谎b液量變量，分析不同裝液量對(duì)富硒富鍺酵母含量的影響。

2.6 不同濃度Na2SeO3對(duì)富硒、富鍺酵母含量及生產(chǎn)水平的影響

本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同Na2SeO3含量的添加梯度，依次為：6、8、10、12、14、16 mg/l。其它試驗(yàn)條件均為：培養(yǎng)時(shí)間60 h、接種量10%、溫度30.2℃、米糠添加量為36 g、裝液量 80 ml/250 mg、GeO2添加量 100 mg/l。探究不同濃度Na2SeO3對(duì)富硒、富鍺酵母含量及有機(jī)硒生產(chǎn)水平的影響。

2.7 不同濃度GeO2對(duì)富硒、富鍺酵母含量及生產(chǎn)水平的影響

本試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)不同GeO2含量的添加梯度，依次為：60、80、100、120、140、160 mg/l。其它試驗(yàn)條件均為：培養(yǎng)時(shí)間60 h、接種量10%、溫度30.2℃、米糠添加量為 36 g、裝液量 80 ml/250 mg、Na2SeO3添加量10 mg/l。探究不同濃度GeO2對(duì)富硒鍺酵母含量及有機(jī)鍺生產(chǎn)水平的影響。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.1 酵母菌的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

從圖1中可以看出，培養(yǎng)時(shí)間在60 h之前，酵母菌的含量逐漸升高，在60 h出現(xiàn)最大值為4.65×105個(gè)。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，酵母菌生長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)，可能是酵母菌的自溶現(xiàn)象、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足以及酵母菌的生長(zhǎng)曲線有關(guān)。綜上可見，富硒、富鍺酵母菌的最佳培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

3.2 不同的酵母菌的接種量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

圖2 不同接種量對(duì)富硒、富鍺酵母菌含量的影響

由圖2可知，當(dāng)酵母菌的接種量在7%～10%時(shí)，富硒、富鍺酵母菌的含量與接種量呈正相關(guān)。當(dāng)接種量為10%，出現(xiàn)最大值為3.43×105個(gè)。在此之后，隨著酵母菌接種量的增大，富硒、富鍺酵母菌含量呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榻湍妇g互相爭(zhēng)奪生存空間以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所致[10]。因此，酵母菌的接種量為10%時(shí)，為富硒、富鍺酵母最佳接種量。

3.3 不同培養(yǎng)溫度對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

不同培養(yǎng)溫度對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響，如圖3所示，溫度對(duì)富硒、富鍺酵母菌含量有著較大的影響。在29.6～30.2℃富硒、富鍺酵母菌的含量是隨著溫度的升高而增大的，在30.2℃時(shí)，酵母菌含量達(dá)最大值，為10.67×105個(gè)。但是隨著溫度高于30.2℃，富硒、富鍺酵母菌的含量呈下降趨勢(shì)，這可能是由于溫度過高影響了酵母菌細(xì)胞中酶的活性，抑制了酵母菌的代謝，導(dǎo)致含量降低[11]。因此，我們選擇30.2℃為最適溫度。

圖3 不同溫度對(duì)富硒、富鍺酵母菌含量的影響

3.4 不同米糠添加量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

圖4 不同米糠添加量對(duì)富硒、富鍺酵母菌含量的影響

由圖4可以看出，當(dāng)米糠的添加量為24～36 g時(shí)，富硒、富鍺酵母菌的含量呈上升趨勢(shì)；這主要可能是因?yàn)殡S著發(fā)酵底物的增加，發(fā)酵混合物的含水量逐漸趨于飽和狀態(tài)，增加了酵母菌有氧呼吸的接觸面積，促進(jìn)了酵母菌的生長(zhǎng)發(fā)育；當(dāng)米糠添加量為36 g時(shí)，富硒、富鍺酵母菌含量達(dá)頂峰，為7.33×105個(gè)；但是，隨著米糠的添加量逐漸增加，酵母菌含量呈下降趨勢(shì)。這可能是由于米糠的含量過多，導(dǎo)致米糠過于干燥，抑制了酵母菌的生長(zhǎng)。因此，選擇米糠添加量為36 g/250 ml為最適添加量。

3.5 不同裝液量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響

不同裝液量對(duì)富硒、富鍺酵母含量的影響，如圖5所示，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)液的含量低于80 ml/250 ml時(shí)，酵母菌的含量呈上升趨勢(shì)；在裝液量為80 ml時(shí)，酵母菌的含量達(dá)最大值，為9.47×105個(gè)；隨著營(yíng)養(yǎng)液的增加，酵母菌的含量呈明顯下降趨勢(shì)。這可能是由于酵母菌無氧呼吸的比例增加，抑制了酵母的數(shù)量。因此，確定最佳裝液量為80 ml/250 ml。

圖5 不同裝液量對(duì)富硒、富鍺酵母菌含量的影響

3.6 不同Na2SeO3添加量對(duì)富硒、富鍺酵母含量及有機(jī)硒生產(chǎn)水平的影響

圖6 不同Na2SeO3添加量對(duì)富硒、富鍺酵母含量及有機(jī)硒生產(chǎn)水平的影響

由圖6可以看出，當(dāng)Na2SeO3添加量在整個(gè)添加梯度中，酵母菌的生物量均有下降趨勢(shì)，這與Na2SeO3的毒性有著密切的關(guān)系，導(dǎo)致酵母菌含量減少[12]。但在Na2SeO3添加量在12 mg/l時(shí)，有機(jī)硒的生產(chǎn)水平呈最大值，為2.27 mg/kg。因此，確定Na2SeO3的添加量為10 mg/l對(duì)酵母菌富集Na2SeO3最適宜。

3.7 不同GeO2添加量對(duì)富硒、富鍺酵母含量及有機(jī)鍺生產(chǎn)水平的影響

圖7 不同GeO2添加量對(duì)富硒鍺酵母含量及有機(jī)鍺生產(chǎn)水平的影響

由圖7可以看出，隨著GeO2添加量逐漸增加，酵母菌的生物量呈下降趨勢(shì)。當(dāng)GeO2添加量為120 mg/l時(shí)，有機(jī)鍺的生產(chǎn)水平最高達(dá)9.80 mg/kg。隨著GeO2添加量繼續(xù)增加時(shí)，有機(jī)鍺的生產(chǎn)水平有下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊腉eO2抑制了酵母細(xì)胞的生長(zhǎng)，導(dǎo)致有機(jī)鍺生產(chǎn)水平下降。因此，確定GeO2的添加量為120 mg/l對(duì)酵母菌的富集GeO2最適宜。

4 結(jié)論

通過本試驗(yàn)可以得出，酵母菌同時(shí)富集有機(jī)硒和有機(jī)鍺的最適條件為：培養(yǎng)基初始pH值為7.0、培養(yǎng)時(shí)間60 h、接種量10%、溫度30.2℃、米糠添加量為 36 g/250 ml、裝液量 80 ml/250 ml、GeO2添加量為120 mg/l、Na2SeO3的添加量為 12 mg/l,從而獲得有機(jī)硒最佳生產(chǎn)水平為2.27 mg/kg，有機(jī)鍺最佳生產(chǎn)水平為9.80 mg/kg。