趙盼，劉真，管靜芝，袁龍，舒彬，尹斌

(1河北北方學院研究生部，河北張家口075000；2中國人民解放軍第309醫(yī)院)

miR-155靶向調(diào)控SP1、E2F2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的功能驗證

趙盼1，劉真2，管靜芝2，袁龍2，舒彬2，尹斌2

(1河北北方學院研究生部，河北張家口075000；2中國人民解放軍第309醫(yī)院)

目的 觀察微小RNA155(miR-155)對端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)調(diào)控相關(guān)蛋白特異性蛋白1(SP1)及轉(zhuǎn)錄因子E2F2重組質(zhì)粒表達的影響，為進一步研究miR-155調(diào)控腫瘤細胞hTERT表達的機制提供實驗基礎。方法 采用生物信息學預測軟件TargetScan和Miranda預測SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR是否是人miR-155的作用靶點。針對SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR設計互補的兩條寡核苷酸，包括目標序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突變序列(SP1-mu、E2F2-mu)，構(gòu)建SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR報告基因載體pMIR-SP1、pMIR-E2F2、pMIR-SP1-mu和pMIR-E2F2-mu。培養(yǎng)HEK-293細胞，采用脂質(zhì)體法將SP1和E2F2的野生型和突變型pMIR-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞24 h。將細胞分為SP1空白對照組、SP1目標序列組、SP1突變序列組、E2F2空白對照組、E2F2目標序列組、E2F2突變序列組，均加入0.2 μg重組質(zhì)粒、0.01 μg對照質(zhì)粒和0.375 μL寡核苷酸，培養(yǎng)24 h。采用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)檢測雙熒光素酶活性，以螢火蟲熒光素酶活性值(F)/海腎熒光素酶活性值(R)比值評價miR-155與SP1及E2F2 mRNA 3′-UTR結(jié)合效果。結(jié)果 在線預測結(jié)果示，SP1 mRNA 3′-UTR和E2F2 mRNA 3′-UTR均有與miR-155完全互補配對的序列，確定二者均為miR-155的靶基因。經(jīng)鑒定，SP1和E2F2報告基因重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。SP1目標序列組F/R低于SP1空白對照組及SP1突變序列組(P均<0.05)，E2F2目標序列組F/R低于E2F2空白對照組及E2F2突變序列組(P均<0.05)。結(jié)論 成功構(gòu)建了SP1和E2F2報告基因重組質(zhì)粒，證實miR-155能夠靶向結(jié)合SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制SP1和E2F2的表達。

特異性蛋白1；E2F2轉(zhuǎn)錄因子；微小RNA155；熒光素酶報告基因；人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶；質(zhì)粒

端粒位于真核生物線狀染色體末端，是維持染色體完整性與穩(wěn)定性的重要結(jié)構(gòu)。端粒酶是細胞內(nèi)具有延長端粒作用的逆轉(zhuǎn)錄酶，可保持端粒伸縮的動態(tài)平衡，彌補DNA復制過程中端粒末端的消耗[1]。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)是端粒酶的主要結(jié)構(gòu)之一，與端粒酶活性有關(guān)[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，hTERT在癌組織及癌前病變組織中高表達，而在正常組織中低表達或不表達[3]。hTERT轉(zhuǎn)錄位點上游的核心啟動子中有與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的位點，與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合后可激活或抑制hTERT表達。特異性蛋白1(SP1)和轉(zhuǎn)錄因子E2F2是與細胞周期調(diào)控有關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子，能夠調(diào)控hTERT的表達[4,5]。微小RNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核細胞中的內(nèi)源性非編碼RNA，參與基因轉(zhuǎn)錄后表達的調(diào)控，其中miRNA155(miR-155)在多種腫瘤組織中高表達，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。但miR-155是否通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子SP1、E2F2進而調(diào)控hTERT的表達，目前尚不明確。2015年3～10月，我們構(gòu)建了SP1及E2F2 mRNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)報告質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染人胚腎HEK-293細胞，與miR-155共培養(yǎng)，觀察miR-155對SP1和E2F2重組質(zhì)粒表達的影響，為進一步研究miR-155調(diào)控腫瘤細胞hTERT表達的機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大腸桿菌感受態(tài)DH5α、對照質(zhì)粒pRL-TK和人胚腎HEK-293細胞由解放軍第309醫(yī)院結(jié)核病研究所孫衛(wèi)國博士惠贈。miR-155模擬物(miR-155 mimics)、miRNA對照劑(miRNA-control)(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)；寡核苷酸片段(Invitrogen公司)；限制性內(nèi)切酶SpeⅠ、Hind Ⅲ、Apa I和T4 DNA連接酶(大連Takara生物有限公司)；Dual-Luciferase報告基因檢測系統(tǒng)(Promega公司)；LipofectmineTM2000和Opti-MEM?Ⅰ不含血清的優(yōu)化培養(yǎng)基(Promega公司)；低溫連接儀(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；IMS-30全自動雪花制冰機(雪科電器有限公司)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(美國Omega Bio-Tek公司)；質(zhì)粒中量制備試劑盒(AxyGen公司)；Gen5酶標儀(美國Bio-Tek公司)；低溫臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)。

1.2 SP1、E2F2 mRNA 3′-UTR與miR-155靶基因互補性預測 采用生物信息學預測軟件TargetScan和Miranda，預測SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR是否是人miR-155的作用靶點。以SP1、E2F2 mRNA 3′-UTR二者與miR-155的結(jié)合序列至少各存在7個互補結(jié)合位點，作為判定SP1和E2F2為人miR-155靶基因的標準。

1.3 SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR報告基因載體的構(gòu)建及鑒定 在TargetScan網(wǎng)站獲取SP1 mRNA 3′-UTR和E2F2 mRNA 3′-UTR與miR-155相結(jié)合的堿基序列，分別對SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR設計互補的兩條50～60 nt寡核苷酸，包括目標序列(即SP1、E2F2野生型序列)及突變序列(SP1-mu、E2F2-mu)，分別在5′端添加SpeⅠ和HindⅢ酶切位點，以備后續(xù)連接，同時插入ApaⅠ酶切位點，作為后續(xù)鑒定的位點。序列如下(下劃線部分為SpeⅠ或HindⅢ酶切位點)：SP1正義鏈為5′-CTAGTGGGCCCCATGGAAGAGAGAGCCATGAAGCATTAAAATGC-ATGGTGTTGAGAAGA-3′，SP1反義鏈為5′-AGCTTC-TTCTCAACACCATGCATTTTAATGCTTCATGGCTCT-CTCTTCCATGGGGCCCA-3′；SP1-mu正義鏈為5′-CT-AGTGGGCCCCATGGAAGAGAGAGCCATGAGTAGC-GCGAATGCATGGTGTTGAGAAGA-3′，SP1-mu反義鏈為5′-AGCTTCTTCTCAACACCATGCATTCGCGCTACTCATGGCTCTCTCTTCCATGGGGCCCA-3′；E2F2正義鏈為5′-CTAGTGGGCCCCACTTTTTAGAAAAGT-TTGTAGCATTAAGCTGGTTTAAAATATGAAGA-3′，E2F2反義鏈為5′-AGCTTCTTCATATTTTAAACCAGCT-TAATGCTACAAACTTTTCTAAAAAGTGGGGCCCA-3′；E2F2-mu正義鏈為5′-CTAGTGGGCCCCACTTTTTA-GAAAAGTTTGTCTAGCGGCGCTGGTTTAAAATATG-AAGA-3′，E2F2-mu反義鏈為5′-AGCTTCTTCATAT-TTTAAACCAGCGCCGCTAGACAAACTTTTCTAAAA-AGTGGGGCCCA-3′。寡核苷酸鏈兩兩互補進行退火，作為與pMIRREPORTTM Luciferace質(zhì)粒(為攜帶熒光素酶基因的載體，以下簡稱為pMIR-Luc質(zhì)粒)連接的目的片段。將空載體pMIR-Luc質(zhì)粒(SpeⅠ或HindⅢ)雙酶切后，與插入的各目的序列連接過夜。連接完成后，將連接產(chǎn)物重組質(zhì)粒pMIR-Luc-SP1、pMIR-Luc-SP1-mu、pMIR-Luc-E2F2和pMIR-Luc-E2F2-mu分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸埃希菌DH5α進行擴增，挑取陽性單克隆菌落搖菌過夜，構(gòu)建SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR報告基因載體pMIR-SP1、pMIR-E2F2、pMIR-SP1-mu和pMIR-E2F2-mu。質(zhì)粒抽提并進行酶切鑒定后，送至北京博艾永華生物科技公司測序。

1.4 細胞培養(yǎng) HEK-293細胞貼壁培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.5 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及分組 采用脂質(zhì)體法將SP1和E2F2的野生型和突變型pMIR-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK-293細胞24 h。轉(zhuǎn)染前24 h，將對數(shù)生長期的HEK-293細胞消化脫壁后，調(diào)整細胞懸液密度至2×105/mL，接種于96孔板，每孔加無抗1640培養(yǎng)基100 μL，37 ℃培養(yǎng)至細胞密度約培養(yǎng)孔面積的75%～80%時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：SP1空白對照組、SP1目標序列組、SP1突變序列組、E2F2空白對照組、E2F2目標序列組、E2F2突變序列組，每組均設3個復孔，用25 μL Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)基稀釋LipofectamineTM2000脂質(zhì)體0.5 μL，輕柔混合，室溫靜置5 min，然后按每孔量用25 μL Opti-MEM?Ⅰ培養(yǎng)基稀釋0.2 μg重組質(zhì)粒、0.01 μg對照質(zhì)粒pRL-TK和0.375 μL寡核苷酸(SP1空白對照組加入pMIR-SP1質(zhì)粒0.2 μg、pRL-TK質(zhì)粒0.01 μg、miRNA-control 0.375 μL；SP1目標序列組加入pMIR-SP1質(zhì)粒0.2 μg、pRL-TK質(zhì)粒0.01 μg、miR-155 mimics 0.375 μL；SP1突變序列組加入pMIR-SP1-mu質(zhì)粒0.2 μg、pRL-TK質(zhì)粒0.01 μg、miR-155 mimics 0.375 μL；E2F2空白對照組加入pMIR-E2F2質(zhì)粒0.2 μg、pRL-TK質(zhì)粒0.01 μg、miR-control 0.375 μL；E2F2目標序列組加入pMIR-E2F2質(zhì)粒0.2 μg、pRL-TK質(zhì)粒0.01 μg、miR-155 mimics 0.375 μL；E2F2突變序列組加入pMIR-E2F2-mu質(zhì)粒0.2 μg、pRL-TK質(zhì)粒0.01 μg、miRNA-155 mimics 0.375 μL)，分別將各組50 μL最終混合物混勻室溫孵育20 min后，加至含細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔，輕柔震蕩培養(yǎng)板混勻，37 ℃、5%CO2條件下孵育細胞，4 h后更換完全1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。

1.6 miR-155與SP1及E2F2 mRNA 3′-UTR結(jié)合效果檢測 采用雙熒光素酶活性檢測實驗。取各組轉(zhuǎn)染后細胞，依據(jù)Dual-Luciferase報告基因檢測試劑盒說明書，使用酶標儀Gen5檢測各孔細胞螢火蟲熒光素酶活性值(F)與海腎熒光素酶活性值(R)，以F/R值作為各孔細胞的相對活性值。

2 結(jié)果

2.1SP1、E2F2mRNA3′-UTR與miR-155靶基因的互補性TargetScan及Miranda在線預測結(jié)果示，SP1mRNA3′-UTR和E2F2mRNA3′-UTR均有與miR-155完全互補配對的序列，其中miR-155與SP1mRNA3′-UTR的98～105位點結(jié)合、與E2F2mRNA3′-UTR的1540～1547位點結(jié)合，其互補結(jié)合序列均在7個位點以上，預測二者均為miR-155的靶基因。

2.2SP1、E2F2mRNA3′-UTR報告基因載體鑒定結(jié)果 酶切鑒定示，SP1、E2F2mRNA3′-UTR重組質(zhì)粒均被成功線性化，出現(xiàn)大小6 500bp左右的條帶。測序結(jié)果證實在SP1、E2F2mRNA3′-UTR中插入的目的片段與設計片段完全相符，見圖1。

圖1 SP1、E2F2 mRNA 3′-UTR報告基因載體測序結(jié)果

2.3 miR-155與SP1 mRNA 3′-UTR結(jié)合效果檢測 SP1空白對照組、SP1目標序列組、SP1突變序列組F/R分別為3 744.93±48.96、2 852.31±340.65、4 356.38±690.45，SP1目標序列組F/R低于SP1空白對照組及SP1突變序列組(P均<0.05)，SP1空白對照組與SP1突變序列組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 miR-155與E2F2 mRNA 3′-UTR結(jié)合效果檢測 E2F2空白對照組、E2F2目標序列組、E2F2突變序列組F/R分別為3 640.64±611.93、2 103.35±137.12、3 066.05±245.93，E2F2目標序列組F/R低于E2F2空白對照組及E2F2突變序列組(P均<0.05)，E2F2空白對照組與E2F2突變序列組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

端粒酶激活是腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素之一。正常人體只有造血細胞、干細胞和成纖維細胞等具有端粒酶活性，而在惡性腫瘤細胞中端粒酶則廣泛存在。hTERT是決定端粒酶活性的關(guān)鍵因素，也是端粒酶的限速亞單位，它的表達受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。SP1是由Kadonaga等[6]發(fā)現(xiàn)的細胞轉(zhuǎn)錄因子，參與細胞的生長分化、癌基因與抑癌基因的調(diào)控、細胞周期調(diào)控等多種生物學進程，與凋亡、腫瘤轉(zhuǎn)移及侵襲關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SP1能與hTERT啟動子特異性結(jié)合，明顯增加轉(zhuǎn)錄活性[4]，被認為是hTERT強大的轉(zhuǎn)錄激活因子。轉(zhuǎn)錄因子E2F2屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族，參與細胞周期的調(diào)控并發(fā)揮重要作用，通過調(diào)節(jié)細胞周期中靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細胞的增殖[7]。E2F家族可根據(jù)其在細胞周期中的作用分為兩大類：激活轉(zhuǎn)錄作用的激活子和抑制轉(zhuǎn)錄作用的抑制子，其中E2F2是轉(zhuǎn)錄激活因子[7,8]。E2F2作為轉(zhuǎn)錄因子能夠在體外和體內(nèi)的增殖肝細胞中調(diào)節(jié)hTERT的差異性表達[5]。

miRNA自發(fā)現(xiàn)以來，由于其對基因的靶向調(diào)控和在生物學中的重要作用而成為研究熱點[9～11]。miRNA可通過互補結(jié)合特定的mRNA 3′-UTR，從而降解目的mRNA，或抑制其轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)翻譯，負向調(diào)控靶基因的表達水平[12]。miRNA可與多種靶基因結(jié)合，一種miRNA可能調(diào)控千百種靶基因。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA對于腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控發(fā)揮重要的作用，其中miR-155被證實在多種腫瘤組織中高表達，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可能通過結(jié)合多種靶基因來抑制腫瘤的發(fā)生，miR-155在肝細胞癌中高表達，通過上調(diào)癌基因胰島素樣生長因子Ⅱ、胰島素樣生長因子I型受體和下調(diào)抑癌基因胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白3，促進肝細胞癌的增殖和遷移[13]。miR-155可通過抑制叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子O1增加ROS的產(chǎn)生，從而促進非小細胞肺癌的細胞增殖[14]。miR-155還可靶向結(jié)合X連鎖凋亡抑制蛋白，調(diào)控順鉑誘導的卵巢癌細胞凋亡，是增加卵巢癌干預效果的潛在治療靶點[15]。

目前研究已證實，miRNA能夠通過調(diào)控hTERT的表達來影響端粒及腫瘤的生長，如miR-1182在轉(zhuǎn)錄后水平通過與hTERT的開放閱讀框相結(jié)合，調(diào)控hTERT的表達，抑制胃癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[16]。Kasiappan等[17]研究表明，在卵巢惡性腫瘤中miR-498低表達，miR-498能與hTERT的3′UTR靶向結(jié)合，抑制hTERT的mRNA水平，這可能是miRNA調(diào)節(jié)端粒酶的新機制。因此，研究miRNA在hTERT調(diào)控中的作用，對于進一步明確腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預防具有重要意義。

目前，miRNA調(diào)控hTERT的具體機制及轉(zhuǎn)錄因子在該調(diào)控通路中發(fā)揮的作用尚未見報道。報告基因?qū)嶒炇茄芯縨iRNA對靶基因調(diào)控最常用的方法。本研究采用Targetscan在線預測方法，發(fā)現(xiàn)miR-155與轉(zhuǎn)錄因子SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR互補配對，提示miR-155在mRNA序列水平可與SP1和E2F2互補結(jié)合并調(diào)控二者的表達；轉(zhuǎn)染后SP1目標序列組F/R低于SP1空白對照組及SP1突變序列組，表明miR-155能與SP1互補結(jié)合，抑制SP1 mRNA的表達；轉(zhuǎn)染后E2F2目標序列組F/R低于E2F2空白對照組及E2F2突變序列組，表明miR-155能與E2F2互補結(jié)合，抑制E2F2 mRNA的表達，以上結(jié)果表明，SP1和E2F2均是miR-155直接調(diào)控的靶基因。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了SP1和E2F2報告基因重組質(zhì)粒，證實miR-155能夠靶向結(jié)合SP1和E2F2 mRNA 3′-UTR，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制SP1和E2F2的表達，為后續(xù)研究miR-155靶向調(diào)控腫瘤細胞hTERT的表達提供了實驗依據(jù)。

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國家自然科學基金資助項目(81170329)；全軍醫(yī)學科技青年培育項目(15QNP049);解放軍309醫(yī)院院管課題(2014MS-001)。

管靜芝(E-mail: jzjz1970@hotmail.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.46.009

R730.231

A

1002-266X(2016)46-0035-04

2016-05-14)