崔 紅，趙美香，劉 毅

脈沖電磁場對db/db鼠胰島素抵抗的改善作用

崔 紅，趙美香，劉 毅

目的 研究脈沖電磁場對胰島素抵抗的治療效果，為2型糖尿病提供新的治療手段。方法 以雌性C57BL/KsJ小鼠為對照，16只雌性C57BL/6Jdb/db小鼠隨機分為db/db組及脈沖電磁場處理組（PEMF組），db/db組不予特殊處理，PEMF組在頻率15 Hz，場強20 Gs的脈沖電磁場中接受刺激2 h/d，共12周。實驗結(jié)束后檢測血糖、血清胰島素，計算HOMA－IR；檢測肝三酰甘油、丙二醛及谷胱甘肽含量。結(jié)果 與db/db組小鼠相比，PEMF組小鼠血糖、血清胰島素含量及HOMA－IR降低（P＜0.05）；肝三酰甘油、丙二醛含量降低，谷胱甘肽含量升高（P＜0.05）。結(jié)論 脈沖電磁場能夠改善db/db鼠胰島素抵抗，減輕肝脂肪變，降低肝氧化應(yīng)激水平。

脈沖電磁場；胰島素抵抗；肝脂肪變；氧化應(yīng)激

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是當(dāng)前威脅人類健康最重要的慢性非傳染病之一［1］。大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，近年來T2DM患者死亡率急劇上升［1］。其主要發(fā)病機制與治療難點是胰島素抵抗（insulin resistance，IR），表現(xiàn)為胰島素作用靶組織對其敏感性降低，胰島素?zé)o法有效降低血糖，導(dǎo)致血糖升高等代謝紊亂，常伴隨肥胖、血壓升高等其他改變［2］。大量研究結(jié)果表明，氧化應(yīng)激（oxidative stress）在IR發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，且抗氧化手段可為T2DM治療提供有效輔助［］。

脈沖電磁場 （pulsed electromagnetic fields，PEMF）的特點是頻率范圍在6～500 Hz，位于電磁頻譜低端［4］。PEMF波形的另一個特點是變化速率高，可在通過組織內(nèi)產(chǎn)生生物電流發(fā)揮特殊的生物學(xué)效應(yīng)，而非通過產(chǎn)生電離輻射或產(chǎn)熱發(fā)揮作用。PEMF治療膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎可有效緩解疼痛、改善功能［5］。

有研究表明，對神經(jīng)節(jié)細(xì)胞SH－SY5Y細(xì)胞系施加PEMF預(yù)處理，可在不改變其余生理指標(biāo)的前提下，有效提高其超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）含量，并減輕后續(xù)給予H2O2造成的細(xì)胞損傷［6］。然而PEMF針對IR是否有效尚未見報道，因此，筆者以T2DM動物模型C57L/6Jdb/db小鼠為研究對象，給予PEMF處理，觀察對IR等的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8只8周齡SPF級雌性C57BL/KsJ小鼠及16只8周齡SPF級雌性C57BL/6Jdb/db小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究中心。標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)：溫度（24±2）℃，相對濕度50%±10%，12 h/12 h交替照明避光。飼料由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，自由攝食水。

1.2 主要試劑與儀器 卓越金銳血糖試紙、羅氏卓越型血糖儀購自上海羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司；油紅O購自上海紫一試劑廠；小鼠胰島素ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；三酰甘油、MDA、GSH測試盒購自南京建成生物工程有限公司。BX51正置熒光顯微鏡購自O(shè)lympus有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組與處理 8只C57BL/KsJ小鼠為對照組；16只C57BL/6Jdb/db小鼠隨機分為db/db組及脈沖電磁場處理組即PEMF組。db/db組小鼠未進(jìn)行任何特殊處理，PEMF組小鼠每天在頻率為15 Hz，場強為20 Gs的PEMF中接受刺激2 h，共12周。

1.3.2 空腹血糖、胰島素測定及HOMA-IR計算小鼠禁食過夜，取尾尖靜脈血檢測空腹血糖。處死前乙醚麻醉動物，摘眼球取全血，37℃靜置2 h，3000 rpm離心10 min，取上清，凍存于-20℃，使用胰島素ELISA試劑盒測定血清胰島素含量。穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IR=空腹血糖（mmol/ L）×空腹胰島素（mIU/L）/22.5。

1.3.3 肝三酰甘油檢測 乙醚麻醉后處死動物，迅速摘取肝后凍存于-80℃?zhèn)溆?。使用油紅O染色方法檢測肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積水平。取新鮮肝制備成10 μm厚的冰凍切片。使用油紅O染液室溫下染色10 min，PBS洗3次后光鏡下觀察、拍照。油紅O染液配制：儲備液為5 mg/ml的油紅O異丙醇溶液，工作液為6 ml儲備液加4 ml去離子水稀釋、過濾后使用。使用預(yù)冷的無水乙醇，按100 mg肝組織∶0.9 ml無水乙醇的比例進(jìn)行冰上機械勻漿，勻漿液3000 rpm離心10 min，取上清，使用南京建成生物工程有限公司三酰甘油測試盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書操作。

1.3.4 肝丙二醛與谷胱甘肽檢測 使用預(yù)冷的生理鹽水，按100 mg肝組織∶0.9 ml生理鹽水的比例進(jìn)行冰上機械勻漿，勻漿液3000 rpm離心15 min，取上清，分別使用南京建成生物工程有限公司丙二醛與谷胱甘肽測試盒進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 PEMF改善db/db鼠胰島素抵抗

2.1.1 PEMF降低db/db鼠血糖 測定空腹血糖，結(jié)果如圖1A所示，對照組血糖為（4.08±0.17）mmol/ L，db/db鼠為（30.32±1.64）mmol/L，經(jīng)PEMF刺激的db/db鼠為 （22.92±2.23）mmol/L，PEMF刺激可使db/db鼠血糖明顯降低。

2.1.2 PEMF降低db/db鼠血清胰島素水平 測定空腹血清胰島素水平，結(jié)果如圖1B所示，對照組血清胰島素為 （10.82±1.08）mIU/L，db/db鼠為（6.72±0.45）mIU/L，經(jīng)脈沖電磁場刺激的db/db鼠為（3.53±0.55）mIU/L，PEMF刺激可使db/db鼠血胰島素水平明顯降低。

2.1.3 PEMF改善db/db鼠胰島素抵抗 根據(jù)空腹血糖與血清胰島素水平計算HOMA-IR，結(jié)果如圖1C所示，對照組HOMA-IR為2.13±0.21，db/db鼠為6.97±0.44，經(jīng)PEMF刺激的db/db鼠為4.00± 0.54，PEMF刺激可使db/db鼠HOMA-IR明顯降低。

2.2 PEMF改善db/db鼠肝脂肪變 肝冰凍切片油紅O染色結(jié)果如圖2A所示，與對照組相比，db/ db鼠肝細(xì)胞內(nèi)大量紅染脂滴聚集，經(jīng)PEMF刺激的db/db鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴數(shù)量、體積均顯著降低。肝三酰甘油含量檢測結(jié)果如圖2B所示，對照組肝三酰甘油含量為（5.61±0.31）mmol/gprot，db/db鼠為（7.60±0.21）mmol/gprot，經(jīng)PEMF刺激的db/db鼠為（4.49±0.86）mmol/gprot，PEMF刺激可使db/db鼠肝三酰甘油含量明顯降低。

圖1 PEMF降低db/db鼠血糖及胰島素水平并改善db/db鼠胰島素抵抗

圖2 PEMF改善db/db鼠肝脂肪變

2.3 PEMF改善db/db鼠肝氧化應(yīng)激

2.3.1 PEMF降低db/db鼠肝MDA水平 測定肝MDA水平，結(jié)果如圖3A所示，對照組肝MDA為 （1.70±0.07）nmol/mgprot，db/db鼠為 （2.45± 0.18）nmol/mgprot，經(jīng) PEMF刺激的 db/db鼠為（1.66±0.08）nmol/mgprot，PEMF刺激可使db/db鼠肝丙二醛水平明顯減低。

2.3.2 PEMF升高db/db鼠肝GSH水平 測定肝GSH水平，結(jié)果如圖3B所示，對照組肝GSH為（3.12±0.41）mg/gprot，db/db鼠為 （0.97±0.17）mg/ gprot，經(jīng)PEMF刺激的db/db鼠為（1.67±0.23）mg/ gprot，PEMF刺激可使db/db鼠肝谷胱甘肽水平升高。

圖3 PEMF改善db/db鼠肝氧化應(yīng)激

3 討論

近年來，隨著生活水平的不斷提高，人群普遍存在久坐少動、高熱量飲食等不良生活習(xí)慣，導(dǎo)致肥胖、IR以及T2DM發(fā)病率逐年升高。目前，治療T2DM主要依賴改善生活習(xí)慣，使用降糖藥，以及補充外源性胰島素的方法控制病情進(jìn)展，因而發(fā)現(xiàn)新的有效的治療手段至關(guān)重要。肥胖是T2DM患者的特點之一，IR是T2DM主要的發(fā)病原因與治療難點，大量研究結(jié)果證實，氧化應(yīng)激可能是導(dǎo)致IR發(fā)生進(jìn)展的重要因素，因此筆者以經(jīng)典的T2DM模式動物C57L/6Jdb/db小鼠為研究對象，給予PEMF處理，觀察該處理對IR、肥胖及氧化應(yīng)激的改善作用。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過12周的PEMF刺激，db/db鼠血糖、血胰島素及胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)指數(shù)HOMA-IR均顯著降低，表明PEMF刺激對IR具有良好的治療作用。同時db/db鼠肝脂肪變（liver steatosis）顯著減輕，且肝內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志性產(chǎn)物丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量顯著降低，而抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量顯著升高，表明PEMF對肝脂肪變具有治療作用，同時有效減輕肝氧化應(yīng)激水平。

肥胖分為皮下脂肪蓄積與內(nèi)臟脂肪蓄積兩類，新近研究表明，不同肥胖類型對肥胖相關(guān)疾病的影響具有顯著區(qū)別，肝等內(nèi)臟脂肪大量蓄積與T2DM等疾病發(fā)生關(guān)系更為密切［7，8］。肝作為機體代謝三大營養(yǎng)物質(zhì)的主要器官，對血糖的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要，有多項研究結(jié)果表明，通過運動與飲食控制、中藥治療、甚至振動等不同手段消除肝內(nèi)蓄積脂肪，可有效降低血糖，改善IR［9，10］。

活性氧水平升高在肝脂肪變發(fā)生與進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。活性氧可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子（如SREBP1c）等表達(dá)進(jìn)而調(diào)控脂質(zhì)合成［11］。同時脂質(zhì)蓄積過多造成的脂負(fù)載可導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)損傷，削弱其氧化磷酸化功能，加重氧化應(yīng)激［12］。氧化應(yīng)激可通過抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或直接損傷線粒體等途徑導(dǎo)致IR。因此，改善氧化應(yīng)激，降低活性氧水平，能夠改善肝脂肪變，改善肝功能及對胰島素的敏感性。

筆者認(rèn)為PEMF可通過降低機體氧化應(yīng)激水平，抑制肝脂質(zhì)合成，減輕肝脂肪變進(jìn)而改善IR。同時，由于未發(fā)現(xiàn)有針對PEMF的不良反應(yīng)報道，因此認(rèn)為該方法可能適用于嚴(yán)重肥胖或行動不便的老年T2DM患者，作為常規(guī)藥物治療的輔助治療手段。針對T2DM患病人群的具體治療參數(shù)，有待進(jìn)一步研究。

［1］Wild S，Roglic G，Green A，et al.Global prevalence of diabetes：estimates for the year 2000 and projections for 2030［J］.Diabetes Care，2004，27（5）：1047-1053.

［2］Chan JM，Rimm EB，Colditz GA，et al.Obesity，fat distribution，and weight gain as risk factors for clinical diabetes in men［J］. Diabetes Care，1994，17（9）：961-969.

［3］海春旭.自由基醫(yī)學(xué)［M］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2006：365-373.

［4］Rosso F，Bonasia DE，Marmotti A，et al.Mechanical stimulation（pulsed electromagnetic fields"PEMF"and extracorporeal shock wave therapy"ESWT"）and tendon regeneration：A possible alternative［J］.Front Aging Neurosci，2015，7（2）：211.

［5］Ryang We S，Koog YH，Jeong KI，et al.Effects of pulsed electromagnetic field on knee osteoarthritis：a systematic review［J］. Rheumatology（Oxford），2013，52（5）：815-824.

［6］Osera C，Amadio M，F(xiàn)alone S，et al.Pre-exposure of neuroblastoma cell line to pulsed electromagnetic field prevents H2O2-induced ROS production by increasing MnSOD activity［J］.Bioelectromagnetics，2015，36（3）：219-232.

［7］Pischon T，Boeing H，Hoffmann K，et al.General and abdominal adiposity and risk of death in Europe［J］.N Engl J Med，2008，359（20）：2105-2120.

［8］Hassan HA，El-Gharib NE.Obesity and clinical riskiness relationship：Therapeutic management by dietary antioxidant supplementation-a review［J］.Appl Biochem Biotechnol，2015，176（3）：647-669.

［9］Tan Y，Kamal MA，Wang ZZ，et al.Chinese herbal extracts（SK0506）as a potential candidate for the therapy of the metabolic syndrome［J］.Clin Sci（Lond），2011，120（7）：297-305.

［10］Liu Y，Zhai M，Guo F，et al.Whole body vibration improves insulin resistance in db/db mice：amelioration of lipid accumulation and oxidative stress［J］.Appl Biochem Biotechnol，2016，179（5）：819-829.

［11］Sekiya M，Hiraishi A，Touyama M，et al.Oxidative stress induced lipid accumulation via SREBP1c activation in HepG2 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2008，375（4）：602-607.

［12］劉 穎，傅 晗，師騰瑞，等.高脂飼料喂飼C57小鼠誘發(fā)胰島素抵抗過程中肝臟氧化應(yīng)激水平及Nrf2、NRF-1和mtTFA蛋白表達(dá)的變化［J］.癌變·畸變·突變，2015，27（3）：191-196.

［2016－05－18收稿，2016－06－15修回］ ［本文編輯：王軍紅］

Role of pulsed electromagnetic fields for improving insulin resistance in db/db mice

CUI Hong①，ZHAO Mei－xiang，LIU Yi.①Dept.of Gynecology，the First Qingdao Sanatorium of Navy，Qingdao，Shandong 266071，China

ObjectiveTo investigate the effect of palse electromagnetic field on improving insulin resistance，so as to provied novel treatment of type 2 DM.MethodsThe 8 female C57BL/KsJ mice were as control group.And another 16 female mice were randomly divided into 2 groups，i.e mice in db/db group were not given any administration while mice were given pulsed electromagnetic fields（PEMF）administration of 15 Hz frequency and 20 Gs field intensity 2h per day for 12 weeks namely PEMF group.Then the blood glucose and insulin levels were detected and the HOMA－IR were calculated.The levels of triglycerid（TG），malonaldehyde（MDA）and glutathione（GSH）in liver were determinated.ResultsCompared with mice in db/db group，blood glucose，insulin level and HOMA－IR of mice in PEMF group decreased significantly（P＜0.05）.Hepatic TG，MDA decreased while GSH increased（P＜0.05）.ConclusionPEMF could improve insulin resistance，alleviate liver steatosis and hepatic oxidative stress.

Pulsed electromagnetic fields；Insulin resistance；Liver steatosis；Oxidative stress

R587.1

A

10.14172/j.issn1671－4008.2016.12.021

266071山東青島，海軍青島第一療養(yǎng)院婦科（崔紅），療養(yǎng)一科（趙美香）；266102山東青島，海軍潛艇第一基地后勤部醫(yī)院（劉毅）