■王盛楠 周 博 肖風(fēng)林 王 密 姚佳穎 楊家新 李 垚* 尹文哲

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究所，黑龍江哈爾濱 150030；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，黑龍江哈爾濱 150086）

槲皮素（3,3',4',5,7-五羥基黃酮）是一種廣泛存在于植物中的物質(zhì)[1-3]，在抗氧化、抗癌、抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面具有獨(dú)特的生物學(xué)和藥理學(xué)功能[4-9]。雖然其作用機(jī)制尚未明確，但大量研究表明，槲皮素的生理功能與其抗氧化的特性有關(guān)[10-12]。槲皮素作為一種天然黃酮類物質(zhì)，其有望替代抗生素在畜禽飼料中使用，以提高畜產(chǎn)品安全，維持畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展。然而，槲皮素作為飼料添加劑在動(dòng)物生產(chǎn)中使用的安全性評(píng)價(jià)尚未明確。

本課題組前期研究表明，槲皮素可提高蛋雞產(chǎn)蛋率和蛋黃卵磷脂含量，降低蛋黃膽固醇含量[13]；前期的急性毒性和慢性毒性的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，槲皮素的半數(shù)致死量大于10 mg/(kg·BW)，表明槲皮素屬于無(wú)毒類物質(zhì)。在飼糧中添加槲皮素對(duì)大鼠和蛋雞分別進(jìn)行30 d和56 d的飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮素對(duì)大鼠和蛋雞均未引起慢性毒性[14]。因此，本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌突變株（TA97、TA98、TA100和TA102）和小鼠進(jìn)行致突變性檢測(cè)（Ames）、骨髓微核以及精子畸形試驗(yàn)，以進(jìn)一步評(píng)估槲皮素作為飼料添加劑在體內(nèi)體外的致突變性。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)受試物

槲皮素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度為98%（HPLC）。

1.2 試驗(yàn)菌株

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100和TA102，由黑龍江省疾病預(yù)防控制中心提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠，由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 Ames試驗(yàn)

選取鼠傷寒沙門氏菌突變菌株TA97、TA98、TA100和TA102作為試驗(yàn)菌株，試驗(yàn)分為7組，分別是5個(gè)槲皮素試驗(yàn)組以及陽(yáng)性和陰性對(duì)照組。試驗(yàn)組槲皮素的劑量為每皿8、40、200、1 000、5 000 μg，在肝微粒體多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)劑（9 000×g Supernatant，S9）不干預(yù)的情況下，陽(yáng)性對(duì)照組分別添加50.0、1.5、10.0 μg和50.0 μg的敵克松和疊氮鈉；在S9干預(yù)的情況下，陽(yáng)性對(duì)照組分別添加50.0、1.5、10.0 μg和50.0 μg的2-乙酰氨基芴和1，8-二羥蒽醌。陰性對(duì)照組添加每皿0.1 ml蒸餾水。試驗(yàn)分別在肝微粒體多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)劑（9 000×g Supernatant，S9）干預(yù)和不干預(yù)的條件下進(jìn)行，每個(gè)劑量設(shè)置3個(gè)平皿，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。記錄每皿回復(fù)突變菌落數(shù)。

1.4.2 骨髓微核試驗(yàn)

將50只昆明種小鼠（6～8周齡，體重25～35 g，25只雄性和25只雌性）隨機(jī)分為5組，每組10個(gè)重復(fù)。槲皮素試驗(yàn)組分別灌胃給藥500、5 000 mg/(kg·BW)和10 000 mg/(kg·BW)，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射40 mg/(kg·BW)環(huán)磷酰胺，陰性對(duì)照組灌胃給藥等體積0.5%羧甲基纖維素。試驗(yàn)共給藥2次，間隔24 h，第2次給藥后6 h處死小鼠。取胸骨制片、鏡檢。計(jì)算小鼠嗜多染紅細(xì)胞（Poly?chromatic erythrocyte，PCE）、成熟紅細(xì)胞（Red blood cell，RBC）數(shù)量及PCE/RBC比值。每只小鼠計(jì)數(shù)1 000個(gè)PCE，骨髓微核率（‰）=微核細(xì)胞數(shù)/檢查細(xì)胞總數(shù)×1 000。

1.4.3 精子畸形試驗(yàn)

將50只昆明種雄性小鼠（6～8周齡，體重25～35 g）隨機(jī)分為5組，每組10個(gè)重復(fù)。槲皮素試驗(yàn)組分別灌胃給藥500、5 000 mg/(kg·BW)和10 000 mg/(kg·BW)，陽(yáng)性對(duì)照組腹腔注射40 mg/(kg·BW)環(huán)磷酰胺，陰性對(duì)照組灌胃給藥0.5%羧甲基纖維素(槲皮素試驗(yàn)組、陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組的給藥體積均相同)。試驗(yàn)每日給藥1次，連續(xù)5 d，在第1次給藥后35 d處死小鼠。取精子經(jīng)常規(guī)蘇木精-伊紅（Hematoxylinand Eeosinstaining，HE）染色法制成切片，每張切片在OLYMPUS CH20光學(xué)顯微鏡下鏡檢1 000個(gè)完整精子，計(jì)算精子畸形率。

1.5 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；其中Ames和骨髓微核試驗(yàn)結(jié)果采用卡方檢測(cè)方法分析；精子畸形試驗(yàn)結(jié)果采用One-way ANOVA分析和Duncan's法進(jìn)行多重比較。以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 Ames試驗(yàn)（見(jiàn)表1～表4）

表1 槲皮素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第1次Ames試驗(yàn)，不加S9，個(gè)/皿)

表2 槲皮素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第1次Ames試驗(yàn)，加S9，個(gè)/皿)

表3 槲皮素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第2次Ames試驗(yàn)，不加S9，個(gè)/皿)

表4 槲皮素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復(fù)突變菌落數(shù)的影響(第2次Ames試驗(yàn)，加S9，個(gè)/皿)

由表1、2、3和表4可見(jiàn)，與陰性對(duì)照相比，在加S9和不加S9的情況下，槲皮素試驗(yàn)組鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復(fù)突變菌落數(shù)無(wú)顯著差異（P＞0.05），但陽(yáng)性對(duì)照組鼠傷寒沙門氏菌突變菌株回復(fù)突變菌落數(shù)極顯著增加（P＜0.01）。

2.2 骨髓微核試驗(yàn)（見(jiàn)表5）

表5 槲皮素對(duì)昆明種小鼠PCE/RBC值和骨髓微核率的影響

由表5可見(jiàn)，與陰性對(duì)照組比，槲皮素試驗(yàn)組小鼠PCE/RBC和骨髓微核率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；但與各試驗(yàn)組相比，陽(yáng)性對(duì)照組小鼠PCE/RBC和骨髓微核率極顯著增加（P＜0.01）。

2.3 精子異常檢測(cè)（見(jiàn)表6）

由表6可見(jiàn)，與陰性對(duì)照相比，每組小鼠均存在一定數(shù)量的畸形精子，但槲皮素試驗(yàn)組小鼠精子畸形率無(wú)顯著差異（P＞0.05）；陽(yáng)性對(duì)照小鼠精子畸形率極顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

表6 槲皮素對(duì)昆明種小鼠精子畸形率的影響

槲皮素是一種常見(jiàn)的黃酮類化合物，廣泛存在于天然植物內(nèi)[1-3]。已有試驗(yàn)證明，槲皮素是一種強(qiáng)抗氧化劑[4-9]，且同其他黃酮類化合物相同，都具有清除自由基的功能[15-16]。有大量數(shù)據(jù)表明，槲皮素在體外具有致突變性，但對(duì)這一結(jié)果的安全評(píng)估系統(tǒng)尚未建立，因此，在這種情況下，建立槲皮素作為飼料添加劑而不是治療類藥物的安全性評(píng)價(jià)已成為一個(gè)重要的研究領(lǐng)域。

為了評(píng)估槲皮素的致突變能力，本試驗(yàn)在體外和體內(nèi)兩種試驗(yàn)條件下，對(duì)槲皮素的致突變性進(jìn)行測(cè)試。Ames試驗(yàn)又稱沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，由于鼠傷寒沙門氏菌是一種組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，其在正常培養(yǎng)的情況下，會(huì)產(chǎn)生極少數(shù)的自發(fā)回復(fù)突變，但在外界誘變劑作用后，會(huì)有大量細(xì)菌發(fā)生回復(fù)突變，故可用來(lái)檢測(cè)槲皮素的體外致突變性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，槲皮素試驗(yàn)組鼠傷寒沙門氏菌突變菌株（TA97、TA98、TA100和TA102）回復(fù)突變菌落數(shù)均無(wú)顯著影響。本試驗(yàn)采用骨髓微核和精子畸形試驗(yàn)檢測(cè)槲皮素的體內(nèi)致突變性，兩試驗(yàn)均選取環(huán)磷酰胺作為陽(yáng)性對(duì)照，環(huán)磷酰胺是一種廣譜的抗腫瘤藥物，但臨床試驗(yàn)表明，環(huán)磷酰胺具有致突變性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與陰性對(duì)照組相比，槲皮素試驗(yàn)組小鼠PCE/RBC、骨髓微核率以及精子畸形數(shù)均無(wú)顯著影響。在大多數(shù)對(duì)鼠傷寒沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的體外試驗(yàn)中，在不存在代謝活化的情況下，槲皮素對(duì)鼠傷寒沙門氏菌表現(xiàn)為致突變性[17-24]，同樣在對(duì)大腸桿菌的試驗(yàn)中，在存在或不存在代謝活化的情況下，有研究表明槲皮素可以誘導(dǎo)補(bǔ)氧系統(tǒng)（Supplemental oxygen system，SOS）活性、反向突變以及DNA單鏈斷裂[18-19,23-25]。通過(guò)對(duì)這些細(xì)菌進(jìn)行姐妹染色單體互換、染色體畸變、非常規(guī)DNA合成以及微核形成等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，槲皮素對(duì)包括酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞在內(nèi)的真核細(xì)胞均具有致突變性和遺傳毒性[20,26-29]，與以上研究結(jié)果相反的是，本試驗(yàn)在經(jīng)過(guò)體外鼠傷寒沙門氏菌的鑒定后，用槲皮素對(duì)小鼠進(jìn)行的體內(nèi)試驗(yàn)并沒(méi)有顯示出任何的致突變性。此外，在體內(nèi)試驗(yàn)，采用槲皮素對(duì)小鼠和大鼠進(jìn)行單次和多次灌胃后，進(jìn)行如姐妹染色單體互換、染色體畸變、非常規(guī)DNA合成以及微核形成等體外試驗(yàn)測(cè)試的指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，所有的結(jié)果均一致表明，盡管槲皮素在體外試驗(yàn)中變現(xiàn)為具有致突變的能力，但在體內(nèi)槲皮素不產(chǎn)生任何突變物質(zhì)或遺傳毒性[30-32]。包括由美國(guó)國(guó)家毒理學(xué)計(jì)劃（National Toxi?cology Program，NTP）進(jìn)行的為期2年的嚙齒動(dòng)物的致癌性生物測(cè)定在內(nèi)的大量毒理學(xué)研究進(jìn)一步證實(shí)了槲皮素在體內(nèi)無(wú)致突變性和遺傳毒性，并且研究結(jié)果表明，槲皮素可作為人類口服藥物，其作用過(guò)程沒(méi)有出現(xiàn)任何與安全性相關(guān)的不利證據(jù)[20，23，33]。盡管NTP最初對(duì)雄性大鼠研究得出了一些與增加腎臟腫瘤發(fā)生率有關(guān)的致癌性證據(jù)[20]，但隨后進(jìn)一步研究表明，雄性大鼠腎臟腫瘤率的提高是由慢性腎病惡化介導(dǎo)的，而不是槲皮素的直接作用[32]。

本試驗(yàn)結(jié)果與以上體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果均相同，提示槲皮素在體內(nèi)體外試驗(yàn)中，均不表現(xiàn)出致突變性。此外，本課題組前期研究表明，槲皮素對(duì)小鼠、大鼠和蛋雞均沒(méi)有表現(xiàn)出急性毒性、慢性毒性或亞慢性毒性[14]。

4 結(jié)論

槲皮素在小鼠體內(nèi)和體外均未顯示出致突變性。并且結(jié)合本課題組前期研究槲皮素的急性毒性和亞慢性毒性的試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，在一定劑量范圍內(nèi)，槲皮素可作為一種安全的飼料添加劑。