■高向陽 王方方

（鄭州科技學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院，河南鄭州 450064）

鉻是家畜及畜禽正常生長(zhǎng)和代謝所必需的元素,能刺激糖原合成酶和增強(qiáng)胰島素的活性[1]，并參與機(jī)體內(nèi)多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的新陳代謝，提高繁殖性能，降低膽固醇含量[2],改善肉與蛋品質(zhì)[3]。動(dòng)物飼料中添加鉻可以抗應(yīng)激、調(diào)節(jié)免疫、提高瘦肉率和產(chǎn)仔性能[4-6]。若飼料中的鉻含量不足，會(huì)造成機(jī)體內(nèi)糖原生物合成緩慢以及葡萄糖含量升高。因此，研究飼料中鉻的含量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

飼料中測(cè)定鉻的方法有原子吸收法[7]、分光光度法[7-8]、原子發(fā)射光譜法[9-10]等，原子吸收法和原子發(fā)射光譜法儀器昂貴，分光光度法樣品灰化時(shí)間長(zhǎng),過程繁雜。流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)測(cè)定鉻的含量，具有儀器操作簡(jiǎn)單、自動(dòng)化程度高、分析速度快、試劑用量少、靈敏度高、精密度好、線性范圍寬、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)[11],但是若用標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，需配制5～7個(gè)標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，耗時(shí)長(zhǎng)，且存在一定的作圖誤差。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制時(shí)的溫度、濕度、大氣壓、儀器等工作條件，與樣品測(cè)定時(shí)常不相同，用之前繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定當(dāng)前樣品的測(cè)定結(jié)果，會(huì)引入一定的誤差，需及時(shí)測(cè)定空白、校正或重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，麻煩、費(fèi)時(shí)，給工作帶來不便。目前，尚未見化學(xué)發(fā)光緊密內(nèi)插法快速測(cè)定飼料中的微量鉻的報(bào)道。緊密內(nèi)插法也稱雙標(biāo)準(zhǔn)夾心法或雙標(biāo)準(zhǔn)比較法[11]，該法利用濃度大（ρ1）、?。é?）的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，將待測(cè)試液（ρX）夾在其中，要求ρ1＞ρX＞ρ2。在相同條件下測(cè)定，濃度與測(cè)定信號(hào)有正比關(guān)系，依此完成定量分析。該法已在環(huán)境監(jiān)測(cè)中有所闡述[12]，但用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品中的鉻含量未見文獻(xiàn)報(bào)道。本文將流動(dòng)注射、化學(xué)發(fā)光技術(shù)和緊密內(nèi)插法結(jié)合，使各自的優(yōu)點(diǎn)得到充分發(fā)揮，無需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和測(cè)定空白溶液，工作效率大大提高，為飼料中鉻的測(cè)定提供了新的分析技術(shù)，具有一定的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

551乳豬配合飼料、JD830乳豬濃縮飼料、JD888仔豬濃縮飼料，由鄭州華測(cè)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司提供。

1.2 主要試劑與儀器

XT-9900A型智能微波消解儀/萃取儀（上海新拓分析儀器科技有限公司）、IFFM-E流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀（西安瑞邁分析儀器有限責(zé)任公司）、DL-1電子萬用電爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、雷磁PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

硝酸（洛陽市化學(xué)試劑廠），30%過氧化氫、EDTA（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司），鹽酸（洛陽昊華試劑有限公司），氫氧化鈉（天津市德恩化學(xué)試劑有限公司），98%魯米諾（阿拉丁工業(yè)公司），氯化鉻（CrCl3·6H2O，AR，北京雙環(huán)化學(xué)試劑廠）。

1.25×10-2mol/l魯米諾儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.276 9 g魯米諾于50 ml燒杯中，用0.1 mol/l NaOH溶液溶解并定容至250 ml的棕色容量瓶中，用時(shí)逐級(jí)稀釋。

0.250 0 mg/ml Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取0.128 1g CrCl3·6H2O于50 ml的小燒杯中，加水溶解,用鹽酸調(diào)pH值至2.00，移至100 ml容量瓶,用pH值2.00的鹽酸定容，用時(shí)逐級(jí)稀釋。

0.1 mol/l EDTA：準(zhǔn)確稱取EDTA 3.722 4 g于50 ml的小燒杯中，加熱溶解，移至100 ml容量瓶中定容。

0.04 mol/l H2O2：移取30%H2O20.40 ml于100 ml容量瓶中，加入1 ml 0.1 mol/l EDTA，用水定容至刻度。

以上試劑均為分析純(AR)，實(shí)驗(yàn)所用水均為怡寶純凈水(電導(dǎo)率為2.86 μS/cm)，玻璃儀器用硝酸（1+5）浸泡6～8 h，用純凈水沖洗3遍后投入使用。

1.3 儀器工作條件

流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光儀工作流程如圖1所示，按說明書安裝、預(yù)熱、清洗管道后，在負(fù)高壓450 V,增益1時(shí)，用Luminol-H2O2-Cr3+化學(xué)發(fā)光體系，按表1設(shè)定的參數(shù)運(yùn)行。

圖1 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光流程

表1 IFFM-E流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光分析儀的參數(shù)

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 測(cè)定原理

根據(jù)三價(jià)鉻濃度與發(fā)光信號(hào)呈正比的關(guān)系，選取濃度大小不同的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，將試液的濃度控制在兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液之間，在完全相同的條件下進(jìn)行測(cè)定，由測(cè)得的相對(duì)發(fā)光值和兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度值，按（1）式求得被測(cè)試液中鉻的濃度：

式中：ρx——被測(cè)試液中鉻的濃度(mg/ml)；

ρ1——高濃度鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg/ml)；

ρ2——低濃度鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度(mg/ml)；

I1——ρ1的相對(duì)發(fā)光值；

I2——ρ2的相對(duì)發(fā)光值；

Ix——被測(cè)鉻試液的相對(duì)發(fā)光值。

由（1）式可知，由于測(cè)定的是信號(hào)改變量所相當(dāng)?shù)臐舛雀淖兞?，無需測(cè)定空白信號(hào)和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作方便，結(jié)果計(jì)算簡(jiǎn)單，測(cè)定快速，工作效率較高。

1.4.2 測(cè)定步驟

樣品于研缽中研至過60目尼龍篩，置于廣口瓶中保存。稱取樣品0.200 0 g（稱準(zhǔn)至0.000 1 g）于消解罐中，加9 ml硝酸和1 ml 30%過氧化氫，按表2進(jìn)行消解，冷卻后，將消化液移至燒杯中，用少量水洗滌消解罐2～3次，洗滌水并入燒杯，加熱趕酸至溶液近干后，加入45 ml水、5 ml亞硫酸微沸10 min[13]，冷卻后在酸度計(jì)上用2.4 mol/l鹽酸調(diào)節(jié)pH值至2.00，移至100 ml容量瓶中，用pH值2.00的鹽酸稀溶液定容，混勻備用。移取5.00 ml于50.00 ml容量瓶中，用pH值2.00的鹽酸稀溶液定容至刻度，混勻待測(cè)定。

表2 微波消解儀的參數(shù)設(shè)置

根據(jù)緊密內(nèi)插法的測(cè)定原理，選取pH值2.00濃度為2.50×10-4mg/ml和2.50×10-6mg/ml的兩個(gè)Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，與待測(cè)定試液在相同的條件下測(cè)定其相對(duì)發(fā)光值。根據(jù)（1）式，求得試液中Cr3+的質(zhì)量濃度ρX。按（2）式計(jì)算樣品中Cr3+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：

式中：W——樣品中Cr3+的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(mg/g)；

ρx——被測(cè)定試液中Cr3+的濃度(mg/ml)；

V——樣品消解后定容的總體積(ml)；

m——稱取樣品的質(zhì)量(g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 魯米諾溶液濃度的影響

分別移取1.25×10-2mol/l的魯米諾儲(chǔ)備液0.40、0.80、2.40、4.00、5.60、7.20、8.00 ml于100 ml的容量瓶中，用pH值12.45的NaOH溶液定容至刻度，搖勻后在其他條件固定不變時(shí)依次測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 魯米諾濃度的影響

由表3知，相對(duì)發(fā)光值隨魯米諾濃度不斷增大，當(dāng)濃度大于5.0×10-4mol/l時(shí)，相對(duì)發(fā)光值增加緩慢，從節(jié)省試劑、降低成本方面考慮，選擇5.0×10-4mol/l的魯米諾溶液試驗(yàn)。

2.2 魯米諾溶液酸度的影響

分別移取1.25×10-2mol/l的魯米諾儲(chǔ)備液2.00 ml于7個(gè)50 ml的容量瓶中，用pH值為11.00、11.30、11.60、11.90、12.20、12.50、12.80的NaOH溶液對(duì)應(yīng)定容至刻度，搖勻后在其他條件不變時(shí)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，結(jié)果見表4。

表4 pH值對(duì)反應(yīng)體系的影響

由表4知，酸度對(duì)發(fā)光體系影響較大，魯米諾溶液pH值為11.90時(shí)，測(cè)定體系有最大的相對(duì)發(fā)光值。

2.3 待測(cè)溶液pH值的影響

分別移取0.250 0 mg/ml Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液儲(chǔ)備液50 μl于8個(gè)100 ml的容量瓶中，用pH值為1.80、2.00、2.30、2.50、2.80、3.00、3.20、3.40的稀鹽酸溶液對(duì)應(yīng)定容至刻度，搖勻后在其他條件不變時(shí)依次測(cè)定，結(jié)果見圖2。

圖2表明，Cr3+溶液pH值為2.00時(shí)有最大相對(duì)發(fā)光值。

圖2 Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液pH值的影響

2.4 H2O2溶液濃度的影響

魯米諾溶液濃度為5.0×10-4mol/l（pH值11.90）時(shí)，依次用0.01 mol/l至0.14 mol/l的H2O2對(duì)1.25×10-4mg/ml Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（pH=2.00）進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5。

由表5可知，H2O2溶液濃度為0.02 mol/l時(shí)，相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(即相對(duì)發(fā)光值)最大。

表5 H2O2溶液濃度的影響

2.5 檢出限和定量限

在負(fù)高壓820 V、增益為1，魯米諾溶液為5.0×10-4mol/l（pH值11.90），對(duì)1.25×10-2μg/ml的Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液（pH值2.00）進(jìn)行11次平行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 檢出限、定量限的測(cè)定結(jié)果

由表6可知，按三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算鉻的檢出限為0.83 ng/ml，按十倍標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算鉻的定量限為2.77 ng/ml。

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確移取 2.50 μg/ml的Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.00、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、10.00 ml，分別置于9個(gè)100 ml容量瓶中，用pH值2.00的稀鹽酸溶液定容至刻度，分別配制成0.000、0.012 5、0.025 0、0.050 0、0.075 0、0.100、0.125、0.150、0.250 μg/ml的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在完全相同的條件下依次測(cè)定。以扣除空白后的相對(duì)發(fā)光值為縱坐標(biāo)，以Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見圖3。

由圖3可知，線性回歸方程為y=1 177.2x-81.492，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0，線性關(guān)系良好。

圖3 鉻的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 加標(biāo)回收率

選擇乳豬濃縮飼料JD830為樣品，向樣品中分別加入0.50、2.00、10.00 ml的2.50×10-6mg/ml Cr3+標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照測(cè)定方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表7。

表7 加標(biāo)回收率

由表7結(jié)果表明，加標(biāo)回收率在94.4%～104.0%之間。

2.8 對(duì)照測(cè)定結(jié)果及精密度

在優(yōu)化條件下，分別用標(biāo)準(zhǔn)曲線法和緊密內(nèi)插法對(duì)同一樣品各進(jìn)行3次平行測(cè)定，檢驗(yàn)無可疑值后取平均值報(bào)告，同時(shí)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差S和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD,結(jié)果見表8。

根據(jù)表8所得數(shù)據(jù)，對(duì)兩種方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)[14]可知，兩種方法的精密度無顯著性差異，也不存在顯著的系統(tǒng)誤差，結(jié)論的置信度為95%。

表8 兩種方法的比較

3 結(jié)論

將微波快速溶樣技術(shù)、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光技術(shù)與緊密內(nèi)插分析方法結(jié)合，使他們的優(yōu)點(diǎn)得到了充分發(fā)揮。采用該方法定量測(cè)定飼料等生物樣品中的鉻含量，無需繪制工作曲線和測(cè)定空白溶液，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉、快速靈敏、結(jié)果計(jì)算簡(jiǎn)單的顯著優(yōu)點(diǎn)，方法的檢出限為0.83 ng/ml，定量限為2.77 ng/ml，加標(biāo)回收率在94.4%～104.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD≤1.30%。與標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)照測(cè)定，在置信度為95%時(shí)，通過F檢驗(yàn)和T檢驗(yàn)表明，兩種方法的測(cè)定結(jié)果間不存在顯著的偶然誤差和系統(tǒng)誤差，為飼料中的鉻提供了一種簡(jiǎn)便、新穎、靈敏、準(zhǔn)確的測(cè)定方法，有一定的推廣應(yīng)用和科學(xué)參考價(jià)值。